藜蘆生物堿引起小鼠腦細(xì)胞dna損傷的構(gòu)毒關(guān)系研究-中藥學(xué)

1、<p><b>　　摘 要</b></p><p>　　目的：藜蘆為百合科藜蘆屬植物。《南方主要有毒植物》記載，藜蘆根莖葉花均可以引起中毒，地下部分的根莖部毒性為最高。導(dǎo)致中毒的癥狀為：腹部熱痛，流涎，嘔吐，惡心，腹瀉，出汗，虛弱，喪失意識；嚴(yán)重中毒出現(xiàn)脈率異常，大便出血，渾身抽搐，昏迷，最后因停止呼吸而致死。藜蘆生物堿是藜蘆的主要活性成分，同時(shí)又是毒性成分。藜蘆生物堿具有顯著降壓

2、和抗腫瘤等活性，其毒性主要是對神經(jīng)系統(tǒng)和胚胎有影響。表現(xiàn)為引起神經(jīng)系統(tǒng)的鈉離子通道和鈣離子通道持續(xù)放電，以及導(dǎo)致多種實(shí)驗(yàn)動物致畸現(xiàn)象。由于前期發(fā)現(xiàn)藜蘆生物堿可引起小鼠腦神經(jīng)DNA損傷，結(jié)構(gòu)特征不同，損傷程度也有差異。所以，本課題以藜蘆生物堿為研究對象，探討藜蘆生物堿不同結(jié)構(gòu)特征的單體成分對小鼠腦細(xì)胞DNA損傷的影響，建立構(gòu)毒關(guān)系，以期為藜蘆進(jìn)一步的毒理研究提供理論依據(jù)。</p><p>　　方法：細(xì)胞DNA損傷與

3、修復(fù)、DNA交聯(lián)、放射生物學(xué)及遺傳毒理等領(lǐng)域的研究，廣泛用彗星實(shí)驗(yàn)（單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)）在單細(xì)胞水平上檢測DNA損傷。本實(shí)驗(yàn)采用彗星實(shí)驗(yàn)的方法檢測19種不同結(jié)構(gòu)特征的藜蘆生物堿對小鼠小腦和大腦皮層腦細(xì)胞DNA損傷作用，并且分為不同劑量組給藥，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來比較其損傷程度，探討藜蘆生物堿引起小鼠腦細(xì)胞DNA損傷的結(jié)構(gòu)與毒性的關(guān)系。</p><p>　　結(jié)果：用CASP軟件對彗星實(shí)驗(yàn)所得的細(xì)胞DNA損傷圖分析，對數(shù)值

4、進(jìn)行匯總得出：母核結(jié)構(gòu)為西藜蘆堿類和介藜蘆胺類，對DNA損傷基本強(qiáng)于母核結(jié)構(gòu)為維藜蘆堿類、番茄立定堿類；介藜蘆胺類結(jié)構(gòu)中D環(huán)為苯環(huán)結(jié)構(gòu)的藜蘆胺（Veratramine）引起DNA損傷顯著，藜蘆胺結(jié)構(gòu)3位葡萄糖苷化的藜蘆新堿（Veratrosine）引起DNA損傷較顯著；西藜蘆堿類結(jié)構(gòu)中有12位羥基取代的12β-羥基藜蘆酰棋盤花堿（12β-hydroxylveratroylzygadenine）引起DNA損傷顯著。</p>

5、<p>　　結(jié)論：藜蘆生物堿對小鼠小腦和大腦皮層細(xì)胞DNA均有不同程度的損傷作用；大部分呈劑量依賴性。不同母核特征的藜蘆生物堿對小鼠小腦和大腦皮層細(xì)胞DNA損傷程度有差異，并且同一母核特征的生物堿所連的取代基團(tuán)結(jié)構(gòu)對損傷程度也有直接的關(guān)聯(lián)性，為后期深入探討其致毒機(jī)理提供理論依據(jù)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：藜蘆生物堿，彗星實(shí)驗(yàn)，DNA損傷，構(gòu)毒關(guān)系</p><p><b&

6、gt;　　ABSTRACT</b></p><p>　　Objective: Liliaceae Veratrum plant.South“Poisonous Plants”records,quinoa phragmites flower stems can be caused by poisoning,toxic roots underground part of the Ministry of t

7、he highest.Lead poisoning symptoms are:abdominal pain,fever,salivation,vomiting,nausea,diarrhea,sweating,weakness,loss of consciousness;severe poisoning appear abnormal pulse rate,bowel bleeding,covered with convulsions,

8、coma,and finally stopped breathing due to death.Alkaloids is the main active ingredient hellebore,but it i</p><p>　　Methods: The study of DNA damage and repair,DNA crosslinking, radiation biology and genetic

9、 toxicology and other areas,widely used comet assay (single cell gel electrophoresis) to detect DNA damage at the single cell level.The experiment using comet assay was used to detect 19 different structural characterist

10、ics of alkaloids mouse cerebellum and cerebral cortex of DNA damage in brain cells,and is divided into different dose group,to compare the extent of damage to the experimental data,explore </p><p>　　Results:

11、 CASP software for cell’s DNA damage resulting figure comet assay analysis,summarize numerical results:core structure for the West hellebore hellebore referral bases and amines,DNA damage in the nucleus of a strong basic

12、 structure for peacekeeping hellebore bases,tomato standing bases;referral hellebore D amine structure veratramine benzene ring structure caused significant DNA damage,veratramine 3 glucoside structure of veratrosine ind

13、uced DNA damage more significant;West Veratrum alkal</p><p>　　Conclusion: alkaloids on mouse cerebellum and cerebral cortex cells have DNA damage of varying degrees;most dose-dependent manner.Different chara

14、cteristics of the nucleus are different alkaloids and extent of the cerebellar cortex cell DNA damage in mice,and features the same nucleus of alkaloids substituents attached structure on the extent of damage also has di

15、rect relevance for post depth To investigate the mechanism of its toxicity to provide a theoretical basis.</p><p>　　Keywords: veratridine,comet assay,DNA damage,Structure poison relationship目 錄</p>&l

16、t;p><b>　　摘 要I</b></p><p>　　ABSTRACTIII</p><p><b>　　第一章 前言1</b></p><p><b>　　一 藜蘆介紹1</b></p><p>　　1．1藜蘆化學(xué)成分研究進(jìn)展1</p>&l

17、t;p>　　1．2 藜蘆藥理研究進(jìn)展3</p><p>　　1．3 藜蘆毒性和毒理研究6</p><p>　　1．4 藜蘆生物堿的代謝研究8</p><p>　　1．5 藜蘆的中藥配伍研究進(jìn)展9</p><p>　　1．6 藜蘆的構(gòu)毒關(guān)系研究10</p><p>　　1．7 本節(jié)小結(jié)11</p&

18、gt;<p>　　二 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)介紹11</p><p>　　2．1 DNA損傷、檢測方法11</p><p>　　2．2 SCGE 實(shí)驗(yàn)發(fā)展簡介12</p><p>　　2．3 SCGE實(shí)驗(yàn)方法13</p><p>　　2．4 SCGE實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用17</p><p>　　三 選題依據(jù)和

19、研究意義18</p><p>　　第二章 藜蘆生物堿引起小鼠腦細(xì)胞DNA損傷的構(gòu)毒關(guān)系研究21</p><p><b>　　一　實(shí)驗(yàn)材料21</b></p><p>　　1．1 實(shí)驗(yàn)動物21</p><p>　　1．2 試劑與藥品21</p><p>　　1．3 實(shí)驗(yàn)儀器23</

20、p><p>　　1．4 分析軟件24</p><p><b>　　二 實(shí)驗(yàn)方法24</b></p><p>　　2．1 試劑的配制24</p><p>　　2．2 樣品給藥24</p><p>　　2．3 細(xì)胞混懸液的制備24</p><p>　　2．4 玻片的制備

21、24</p><p>　　2．5 細(xì)胞的裂解25</p><p>　　2．6 DNA的堿解旋25</p><p><b>　　2．7 電泳25</b></p><p>　　2．8 中和、固定25</p><p>　　2．9 染色、閱片26</p><p>　　2．

22、10 統(tǒng)計(jì)分析26</p><p><b>　　三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26</b></p><p>　　3．1 實(shí)驗(yàn)方法的建立26</p><p>　　3．2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)及作圖27</p><p>　　四 結(jié)論和討論35</p><p>　　4．1 不同藜蘆堿引起小鼠腦部DNA損傷35<

23、/p><p>　　4．2 SCGE實(shí)驗(yàn)方法簡議36</p><p>　　第三章 全文總結(jié)39</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)41</b></p><p>　　攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄51</p><p><b>　　致 謝53</b></p>

24、<p><b>　　第一章 前言</b></p><p><b>　　一 藜蘆介紹</b></p><p>　　百合科植物藜蘆，全世界大概有40種，分布在歐洲、北美和亞洲，《中國植物志》整理記載，在我國藜蘆屬植物大約24種，其中發(fā)現(xiàn)有藥用植物的有13個(gè)種和1個(gè)變種。在上世紀(jì)末期，四川、云南地區(qū)出現(xiàn)2個(gè)新品種有： 貢山藜蘆和南川藜蘆[1

25、]；發(fā)現(xiàn)于秦嶺的有一個(gè)變種：總狀藜蘆[2]。藜蘆屬植物在我國境內(nèi)分布以云、川地區(qū)分布最多，東北、東南、中原地區(qū)也有分布。常用的藥用植物有：藜蘆、蒙自藜蘆、興安藜蘆、狹葉藜蘆、尖被藜蘆等[3]。藜蘆味辛，苦，性寒，有大毒，歸胃，肝，肺經(jīng)。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)里藜蘆用藥早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就有記載，用藥部位在根部和根莖部分。藜蘆對中風(fēng)病痰，喉梗阻，癲癇和惡性瘡，頭痛，黃疸等有治療效果[4]。</p><p>　　1．1藜蘆化學(xué)

26、成分研究進(jìn)展</p><p>　　我國學(xué)者研究中藥藜蘆多年，目前發(fā)現(xiàn)其含有以下幾類化學(xué)成分：</p><p><b>　　1．1．1生物堿類</b></p><p>　　我國研究者對藜蘆屬植物中的生物堿類成分做了深入調(diào)查和研究，在不同品種的藜蘆中發(fā)現(xiàn)了諸多甾體生物堿成分，種類豐富，目前發(fā)現(xiàn)的藜蘆生物堿有100多種。按其生物堿的基本骨架可以分為兩

27、類：異甾生物堿類和膽甾生物堿類。前者又可進(jìn)一步細(xì)分有西藜蘆堿類和介藜蘆堿類；后者又可進(jìn)一步細(xì)分為茄次堿類，維藜蘆堿類和新類型堿類[5]。</p><p>　　具體的生物堿單體有藜蘆[6-8]中的介芬胺，藜蘆明，藜蘆馬林堿，原藜蘆堿，偽介芬胺，藜蘆嗪，紅介芬胺，3-當(dāng)歸?；?jì)明堿、3-雙羥基異戊?；?15-異戊?；?jì)明堿，3-藜蘆酰基計(jì)明喊，3-藜蘆?；灞P花胺，7-乙酰-15-異戊?；?3-藜蘆?；?jì)明堿等。長梗

28、藜蘆[9]中的3-當(dāng)歸酰棋盤花胺， 綠藜蘆堿等。天目藜蘆[10-12]中的天目藜蘆胺A、B；異紅介藜蘆堿、藜蘆托素等。蒙自藜蘆[13]中有藜蘆胺-N-氧化物，藜蘆明寧，3，15-二當(dāng)歸?；?jì)明堿等。烏蘇里藜蘆[14-17]里有介芬胺，新計(jì)巴丁，哥美任，計(jì)巴丁，15-O-(2-甲基丁酰)計(jì)明堿，藜蘆嗪，棋盤花胺，6-羥基-7-甲氧基-2-(3’-羥基-2’，5’-二甲氧基苯基)苯駢呋喃，白藜蘆醇等。尖被藜蘆[18-20 ]里有棋盤花內(nèi)酯，

29、玉紅介芬胺，藜蘆胺，20-異藜蘆胺，介芬胺，23-O-吡喃葡萄糖-20-異藜蘆胺，23-O-吡喃葡萄糖-5，11，13-藜蘆三烯堿-3β-23-二醇等。毛葉藜蘆[18]里有棋盤花辛，參農(nóng)美寧，大花藜蘆嗪，茄定二烯二醇，棋盤花內(nèi)酯，綠藜蘆堿，藜蘆烯酮，異特因明，哈枯繞定，原西藜蘆堿、11－去氧介芬胺等。</p><p><b>　　1．1．2 黃酮類</b></p><p&

30、gt;　　王斌等[27]對藜蘆的化學(xué)成分進(jìn)行研究，分離有異鼠李素，5，7，4’-三羥基-3’-甲氧基黃酮，異槲皮苷，5，7，3’，5’-四羥基黃酮，5，7，3’，4’-四羥基黃酮。Li HL 等[28]從藜蘆中分離出兩個(gè)黃酮苷類化合物，分別是4’-methoxyl-glucotricin和 3’，4-dimethoxyl-quercitrin 。</p><p><b>　　1．1．3 二肽類</

31、b></p><p>　　趙偉杰等[29，30]研究烏蘇里藜蘆，從其根莖中提取出了刺孢麴霉堿和橙黃胡椒酰胺為二肽類成分。</p><p><b>　　1．1．4 茋類</b></p><p>　　趙偉杰[31]從藜蘆根莖中分出2，3’，4，5’一四羥基茋，白藜蘆醇和verussustilbene。毛穗藜蘆中也分得有2，3’，4，5’-四羥

32、基茋和白藜蘆醇[32]，從臺灣產(chǎn)的黑紫藜蘆分得有反式白藜蘆醇[33]。</p><p><b>　　1．1．5 其他</b></p><p>　　楊崇仁等[34]從蒙自藜蘆分得胡蘿卜苷，β-谷甾醇蠟酸和硬脂酸；梁廣義等[26]從狹葉藜蘆分得木蠟酸，β-谷甾醇和硬脂酸；劉冰等[8]對藜蘆進(jìn)行研究分析，分離有：2，3一甲氧基環(huán)杷明，15異戊酰基-3-藜蘆酰基原藜蘆堿；全香

33、花等[35]從興安藜蘆分得胡蘿卜苷和β-谷甾醇；目前，國內(nèi)學(xué)者研究東北產(chǎn)的藜蘆，分離得到藜蘆胺和介芬堿，并且發(fā)現(xiàn)此藜蘆植物中有環(huán)杷明（環(huán)巴胺，11-去氧芥芬胺，Cyclopamine）的存在[36]。</p><p>　　1．2 藜蘆藥理研究進(jìn)展</p><p>　　從藜蘆的根、莖、葉分離出的多種單體成分，研究其對小鼠的急性毒性成分，由LD50進(jìn)行分析判定了西藜蘆堿類引起小鼠中毒比較嚴(yán)重，

34、其是藜蘆中主要的毒性成分[37]。藜蘆中主要的藥理活性成分是生物堿成分，與此同時(shí)其也是藜蘆產(chǎn)生毒性的主要作用部分，一直是學(xué)者們研究的要點(diǎn)。其藥理作用有：</p><p>　　1．2．1降低血壓作用</p><p>　　藜蘆的藥理作用中，降低血壓的作用是最早的被研究出的作用。20世紀(jì)中期就有藜蘆降低血壓的報(bào)道，藜蘆生物堿種類不同，降壓效果有很大區(qū)別[38]。蒙自藜蘆給麻醉貓靜脈給藥0.1g/

35、kg后血壓立即下降，最低降壓率是52-72%，降壓持續(xù)時(shí)間1-2h以上，反復(fù)給藥無快速耐受現(xiàn)象，降血壓作用機(jī)理主要是作用點(diǎn)在于頸動脈竇和反射性使心肺感受區(qū)受到影響引起血壓降低[39]。光脈藜蘆中的生物堿降低血壓作用強(qiáng)而快，劑量增大則降壓效果越明顯。其能明顯降低貓的后肢血管灌注壓，說明其對血管有直接的擴(kuò)張作用。其降壓作用與α、β和M受體無關(guān)，也與組胺的釋放無關(guān)[40]。狹葉藜蘆堿甲降低血壓作用速度快，與其存在擴(kuò)張腦血管的作用有關(guān)[41]。

36、湯建等[42]研究對 RHR大鼠的降低血壓作用，大鼠腦內(nèi)（RHR）的兒茶酚氨(CA)能神經(jīng)元的活性有增強(qiáng)作用。黑藜蘆生物堿用兩種方法股靜脈、椎動脈分別給藥都產(chǎn)生良好的降低血壓的效果，但兩方法的降低血壓作用效果幾乎相同，提示黑藜蘆生物堿是非中樞性的降壓藥。向舌動脈注射黑藜蘆生物堿，瞬膜收縮幅度幾乎沒有改變，提示黑藜蘆生物堿也不阻斷交感神經(jīng)節(jié)。其與組胺受體、腎上腺β受體、M膽堿受體均無關(guān)</p><p>　　王清等[

37、45]研究新型降壓藥藜蘆胺的降壓作用，經(jīng)正常狀態(tài)下的貓、大鼠的十二指腸給藥，藜蘆胺可以顯著降低血壓，使大鼠和貓的心率變慢，劑量越大隨之降壓作用越強(qiáng)。由此推斷出其是藜蘆總生物堿使血壓下降的一個(gè)重要有效部分。趙瑜等[46]考察藜蘆中含量較多的原藜蘆堿A（PA）作用于大鼠呼吸系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)，得出了隨PA濃度增大可以使大鼠收縮壓、舒張壓、平均動脈壓相應(yīng)地下降?？梢越档秃粑l率、升高呼吸幅度，并且之間存在量-效關(guān)系。</p>&l

38、t;p>　　1．2．2 對心臟的作用</p><p>　　狹葉藜蘆堿甲可用于治療高血壓心衰，可以降低心臟的前后負(fù)荷，能抑制心肌的興奮性傳導(dǎo)，明顯降低心肌耗氧和做功，利于緩解心臟的過度負(fù)荷，減慢心律，在實(shí)驗(yàn)劑量合適范圍內(nèi)，不影響心臟的正常泵血功能。與此同時(shí)對其他臟器需血量不產(chǎn)生影響[41]。但如果過量則會引起竇性心律變慢產(chǎn)生毒性作用[68]。</p><p>　　藜蘆混堿是藜蘆中幾種生

39、物堿混合在一起，未經(jīng)純化分離的，以藜蘆定為主成分，藜蘆堿作用于中樞神經(jīng)，引起大腦產(chǎn)生興奮出現(xiàn)痙攣，抽搐，而后大腦出現(xiàn)抑制產(chǎn)生昏迷等意識方面障礙。其已被證實(shí)具有使心肌收縮力增強(qiáng)、鈉通道開放的時(shí)長增加，以藜蘆混堿促進(jìn)鈉通道開放作用于大鼠的離體心臟，進(jìn)行灌流，發(fā)現(xiàn)在濃度低于40.0 mg/L，高于4mg/L時(shí)，心律失?，F(xiàn)象不明顯，但當(dāng)濃度超過40.0mg/L，暫時(shí)的心動過速會出現(xiàn)[47]。</p><p>　　1．2．

40、3 對神經(jīng)作用</p><p>　　藜蘆堿低劑量時(shí)存在良好的降壓效果，高劑量時(shí)神經(jīng)細(xì)胞鈣離子含量增多，導(dǎo)致神經(jīng)興奮，心律失常，細(xì)胞膜去極化，增強(qiáng)膜的興奮性。尼莫地平能降低這種由藜蘆堿引起的細(xì)胞內(nèi)部的鈣離子含量升高現(xiàn)象，并有效地拮抗鈉鈣交換增多，從而防止神經(jīng)細(xì)胞免受損傷。有報(bào)道[48]稱，當(dāng)藜蘆堿濃度在 l.5-5.0μmol/kg可抑制鈉通道失活。</p><p>　　藜蘆堿會引起大鼠感覺

41、神經(jīng)元部發(fā)生觸發(fā)性振蕩[49]。使大鼠的坐骨神經(jīng)受到損傷，把藜蘆堿提取液濃度在5μmol/L，作用于前者，顯示出如山峰狀的放電情況，提示作用機(jī)理是藜蘆堿抑制了鈉離子通道的失活，導(dǎo)致鈉內(nèi)流速度變慢[50]。藜蘆堿溶液在低劑量時(shí)可改變大鼠腦區(qū)海馬的錐體神經(jīng)元放電的模式，引發(fā)慢波癲癇樣電活動，并且抑制突觸傳遞的成分不影響這種癲癇樣放電的產(chǎn)生，但此放電的產(chǎn)生可以被TTX河豚毒素所抑制，它可以阻斷連續(xù)性的鈉內(nèi)流，從而使鈉鈣交換減少，抑制癲癇的發(fā)生

42、 [51]。</p><p>　　1．2．4 抗血栓作用</p><p>　　呂莉等[52]對烏蘇里生物堿里的單體計(jì)米丁進(jìn)行探討，研究其對血栓形成的作用，對機(jī)體內(nèi)、體外的血小板凝集的檢查研究出計(jì)米丁的抑制血栓形成的機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)論得出，靜脈注射計(jì)米丁劑量越高，大鼠的血流阻塞時(shí)間OT越長，提示計(jì)米丁可以抗動脈血栓。李欣燕[53]對烏蘇里藜蘆生物堿的抑制血小板聚集的功效進(jìn)行探討，烏蘇里藜蘆堿可以

43、顯著降低大鼠血小板凝集率，全血凝血時(shí)間增多，使小鼠尾部出血時(shí)間增多。烏蘇里藜蘆總生物堿中的烏蘇瑞寧，是一種甾體類生物堿，其有在體內(nèi)、外血小板凝集過程中起到抑制作用，是烏蘇里藜蘆總生物堿里抑制血栓形成的一個(gè)重要的有效成分[54]。楊靜嫻[55]研究烏蘇里藜蘆生物堿有抗紅細(xì)胞凝集、提高紅細(xì)胞的彈性作用，并使血液里的除細(xì)胞以外與血粘度有關(guān)的的部分含量降低。其可以使小鼠尾部的出血時(shí)間明顯增加，說明具有抑制血小板凝集的功效。更深入研究烏蘇里藜蘆堿

44、（VnA） 在靜脈注射給藥時(shí)引起血小板聚結(jié)率降低，降低血栓素A2（TXA2）水平，升高對抗血栓的前列環(huán)素（PGI2）水平。提示烏蘇里藜蘆堿對血小板凝聚起到抑制作用，其作用機(jī)理與提升血漿中的PGI2/TXA2的值相關(guān)[56]。藜蘆堿明顯抑制動脈和靜</p><p>　　1．2．5 抗腫瘤作用</p><p>　　賈忠建等[58]用藜蘆總堿進(jìn)行了小白鼠藥理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度為20μg/ml，對小

45、白鼠腹水型肝瘤細(xì)胞和S180肉瘤細(xì)胞的DNA合成的磷代謝均有明顯的抑制作用，也對正常的人胚體成纖維細(xì)飽的DNA合成也有抑制作用，說明藜蘆總堿具有細(xì)胞毒性。周劍俠等[59]研究一種介芬胺類生物堿-環(huán)杷明表現(xiàn)出良好的抗腫瘤前景，可以阻斷Hedgehog信號通道，對于環(huán)杷明的研究已經(jīng)成為抗惡性腫瘤領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。介藜蘆堿類環(huán)巴胺對腦、上皮細(xì)胞、胃腸道腫瘤有一定的抑制作用[60]，對老年性前列腺癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤也良好的治療效果[61，62]。&

46、lt;/p><p>　　金善花等[63]研究藜蘆分離純化物可以清除 DPPH 自由基，以及影響人類肺癌PC9細(xì)胞繁殖，水提出的藜蘆化合物在10 mg/ml時(shí)對體外DPPH清除率是52.3%、醇提出的藜蘆化合物在同濃度下清除作用為42.8%。肺癌PC9細(xì)胞的生殖能被藜蘆醇提物顯著抑制，藜蘆醇提物濃度升高抑制作用增強(qiáng)，而藜蘆水提物在濃度很高的情況下才產(chǎn)生這種抑制作用。</p><p>　　1．2．

47、6 殺蟲、抗菌作用</p><p>　　時(shí)清亮等[64]先后用乙醇、氯仿和正丁醇為溶劑，從藜蘆根莖中提取出以下物質(zhì)：乙醇類、正丁醇類、氯仿類的萃取物，并測定了三者對粘蟲、朱砂葉螨、蚜蟲和蚊幼蟲有良好的毒殺作用。0.5%的藜蘆堿可溶性液劑，是一種新式的植物源環(huán)保型殺蟲、殺螨劑。藜蘆堿是從百合科的植物藜蘆中提取的，用乙醇萃取得到，當(dāng)害蟲接觸到或者取食進(jìn)入害蟲體內(nèi)部，產(chǎn)生毒性刺激作用，引起蟲體先興奮后抑制作用，最終作用

48、于中樞，直至害蟲中毒死亡[65]。蘇克躍等[66]試驗(yàn)比較了0.5%藜蘆堿可溶性液體制劑的不同用量和4%魚藤酮乳油對防治柑橘葉螨的田間藥效，得出了前者對防治柑橘葉螨良好效果，并且其量-效關(guān)系呈正相關(guān)。薛兵等[67]對介芬胺和藜蘆胺兩種化合物的抑菌活性進(jìn)行研究，分別用金黃色葡萄球菌、白曲霉菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。通過比較五個(gè)不同濃度分別為1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL藜蘆胺和介芬胺對

49、這四種菌的抑菌圈大小得到其抑菌程度，結(jié)果顯示一定濃度的藜蘆胺對四種菌有不同程度的抑菌能力。</p><p>　　1．2．7治療骨折作用</p><p>　　《中華本草》記載藜蘆能治愈骨折，可以縮短骨骼愈合的時(shí)間，尤其在股骨骨折作用很明顯，愈合時(shí)間在37天左右。但是，愈合時(shí)間與骨折類型、手法復(fù)位技術(shù)有很大關(guān)系。有分析者認(rèn)為，用藜蘆治療骨折，需在骨折處兩端供血良好的條件下才能充分發(fā)揮其作用。用

50、法：黑藜蘆根洗凈、干燥、研磨成粉，加同等量黃連素制成含量10mg之片劑內(nèi)服。成人3次/d，30mg/次，涼開水沖服。服藥作用時(shí)間一般約為2-4周，愈合時(shí)間有個(gè)體差異，還有骨折部位與醫(yī)生的接骨技術(shù)有很大關(guān)系。同時(shí)按常規(guī)程序進(jìn)行復(fù)位、固定。服藥后患者多脈搏加快，全身和局部發(fā)熱；出現(xiàn)有3例患者在肝功符合正常標(biāo)準(zhǔn)的情況下出現(xiàn)了血液中的堿性磷酸酶升高的狀況。</p><p>　　1．3 藜蘆毒性和毒理研究</p>

51、;<p>　　藜蘆植物根、莖、葉均有毒。藜蘆中毒通常是很迅速的，家畜誤食藜蘆進(jìn)入胃腸道30min至接下來幾個(gè)小時(shí)，會出現(xiàn)不安癥狀，例如：持續(xù)嘔吐、腹瀉、腹痛。之后渾身機(jī)能衰退，出現(xiàn)瞳孔放大，體溫、血壓降低，昏迷，最終呼吸變慢至停止。藜蘆作用于中樞，使大腦先興奮而后抑制，其還可作用于迷走神經(jīng)，反射性降低血壓，引起心動緩慢性心律失常。藜蘆總生物堿是藜蘆的主要毒性作用成分，毒性最強(qiáng)的要數(shù)原藜蘆堿，其次是介藜蘆胺毒性也強(qiáng)。<

52、/p><p><b>　　1．3．1心臟毒性</b></p><p>　　Marinov等[68]探討了藜蘆的毒性對人類心臟的影響，實(shí)驗(yàn)中藜蘆造成患者竇性心率變慢，縮短了心電圖PQ，QTC間期，因此得出心率變慢是藜蘆提高了迷走神經(jīng)興奮性；藜蘆對心肌的毒性造成了心電圖的變化。</p><p>　　趙瑜[69]在對原藜蘆堿A的毒性研究中發(fā)現(xiàn)大鼠給藥后血

53、象 NEUT 比例增加， LYMPH 比例減少，說明存在細(xì)菌性感染。血液指標(biāo)CPK、AST、ALP等提升表明其對心、肝、腎等臟器有毒性作用。組織病理學(xué)檢測同樣看出給予藜蘆堿A 的大鼠肺、腎等臟器有彌漫性感染，提示給藥后會引起動物免疫力下降。</p><p>　　孔令浩[70]探討藜蘆定（VER）對家兔心室肌細(xì)胞動作電位的影響，發(fā)現(xiàn)藜蘆定可以特異性引起家兔心室細(xì)胞持續(xù)性鈉內(nèi)流明顯增多至超載，然后逆向引起心室細(xì)胞Na

54、+/Ga2+交換電流增大，鈣離子明顯增多而至超負(fù)荷，進(jìn)而引起動作電位時(shí)程APD時(shí)間延長出現(xiàn)早期后除極EADs，進(jìn)而引起心律紊亂，心功能出現(xiàn)異常。</p><p>　　1．3．2 神經(jīng)毒性</p><p>　　當(dāng)前藜蘆生物堿神經(jīng)毒性研究主要集中在對鈉離子和鈣離子通道的影響，發(fā)現(xiàn)藜蘆堿激活鈉離子通道，引起海馬CAI椎體神經(jīng)元癲癇狀的陣發(fā)放電，對其毒性結(jié)構(gòu)和機(jī)理研究目前還不很清楚[71]。早有研

55、究報(bào)道證實(shí)，藜蘆生物堿是其神經(jīng)毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，可致畸[71-77]。Crawford等人通過轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)也證實(shí)藜蘆生物堿具有基因毒性[78]。</p><p>　　王艷麗等[79]用基因芯片技術(shù)探討藜蘆定堿與SH-SY5Y細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，基因芯片技術(shù)可替代傳統(tǒng)的動物毒理學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行早期的毒性篩查、線索發(fā)現(xiàn)，在毒性線索發(fā)現(xiàn)階段可以給出海量的信息[80]。結(jié)果顯示藜蘆定堿不同劑量組作用于SH-SY5Y細(xì)胞后，和空

56、白對照組細(xì)胞比較，細(xì)胞體積收縮，變圓，樹突數(shù)量減少甚至溶解消失，細(xì)胞增殖率隨劑量增大而降低。并且涉及的細(xì)胞物質(zhì)與能量代謝，細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)的相關(guān)基因表達(dá)有明顯差異，為臨床安全合理應(yīng)用藜蘆和藜蘆神經(jīng)中毒的救治提供參考。</p><p>　　叢悅等人[81,82]通過彗星實(shí)驗(yàn)考察了藜蘆生物堿Germerine、Neogermbudine、neogermine、germine、黑紫藜蘆水提物、黑紫藜蘆總堿對小

57、鼠腦細(xì)胞DNA損傷毒性評價(jià)，發(fā)現(xiàn)藜蘆生物堿是引起腦細(xì)胞DNA損傷的關(guān)鍵性物質(zhì)，并且不同結(jié)構(gòu)特征、不同取代基的生物堿引起小鼠小腦和大腦皮層的DNA損傷程度也不同，表明結(jié)構(gòu)母核或取代基是影響DNA損傷程度的重要因素。在以后的新藥研究開發(fā)中，結(jié)構(gòu)修飾研究可能將是藜蘆減毒不可或缺的一部分。</p><p><b>　　1．3．3遺傳毒性</b></p><p>　　妊娠期母牛

58、妊娠期間食入藜蘆有不同的中毒現(xiàn)象，在不同的階段會導(dǎo)致流產(chǎn)、胚胎畸形甚至死胎[83]。藜蘆堿作用于小鼠、大鼠均有致畸作用，因?yàn)檗继J堿可升高胚胎血糖至50%，中毒之后使葡萄糖利用率降低，腎、肝、肌肉吸收氧的功能降低，使胚胎磷酸鍵的能量有效利用率降低而致畸。</p><p>　　其中毒機(jī)制主要是以下三方面：</p><p>　?。?）藜蘆堿對胃腸道粘膜有刺激作用并且很強(qiáng)，可中毒出現(xiàn)反胃、嘔吐和食

59、管、胃腸炎癥。（2）藜蘆堿引起大腦先興奮而后出現(xiàn)抑制，產(chǎn)生嘔吐、腹痛和頭暈昏迷等不安情緒。（3）藜蘆總堿能提高迷走神經(jīng)的興奮性，引起心率變慢、血壓下降，抑制呼吸。</p><p>　　藜蘆中毒后，立刻使用高錳酸鉀稀釋液0.1%-0.2%、鞣酸稀釋液0.5%-1%、濃茶多次沖洗胃腸道，使毒物盡可能全部排出，之后加服鞣酸使與堿中和而解毒，服用藥用炭可以把毒物吸附而排出。并且采取強(qiáng)心、解痙、緩解呼吸困難等對癥治療措施[

60、84]。美國研究有毒植物的學(xué)者Keeler對羊羔獨(dú)眼畸形原因進(jìn)行了長時(shí)間的探討，1964年終于肯定了藜蘆屬中甾體生物堿是羊羔致畸的主要成分，藜蘆屬植物中某些生物堿是誘發(fā)動物前腦畸形的最顯著的致畸因子。</p><p>　　1．4 藜蘆生物堿的代謝研究</p><p>　　藜蘆定對大鼠體外肝微粒體孵化，產(chǎn)生7個(gè)代謝產(chǎn)物，并采用特異性抑制劑探針方法，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素亞型CYP1A，CYP2B，CY

61、P2E1，CYP3A參與了藜蘆定的體外代謝[85]。金曉艷等人研究烏蘇里藜蘆生物堿(VnA)進(jìn)入小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的藥代動力學(xué)和VnA在小鼠體內(nèi)的蓄積性中毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VnA的LD50(iv)為702µg/kg，對數(shù)體存率與時(shí)間曲線呈現(xiàn)一室模型，VnA在小鼠體內(nèi)的消除過程屬于一級動力學(xué)消除。VnA使小鼠急性中毒的成分在其體內(nèi)消除迅速，其t1/2僅是2.17min。VnA雖然快速引起急性毒性，并且表現(xiàn)嚴(yán)重，但沒有呈現(xiàn)出顯著的蓄積毒性[8

62、6]。叢悅等人研究12β-羥基藜蘆酰棋盤花胺大鼠體內(nèi)、體外代謝研究，共發(fā)現(xiàn)9個(gè)代謝產(chǎn)物，體內(nèi)代謝主要代謝途徑為去氫化、甲基氧化成醛、酯鍵水解及乙酰化、甲氧基化，O-去甲基化[87]。</p><p>　　1．5 藜蘆的中藥配伍研究進(jìn)展</p><p>　　中藥的“十八反”中指出：“諸參辛芍叛藜蘆”，意思是各種參類和細(xì)辛、白芍與藜蘆合用有“相反”的功效。很多學(xué)者在對藜蘆研究領(lǐng)域得出了很多科學(xué)

63、推論，為臨床用藥和研制新藥開發(fā)提供了參考。</p><p>　　朱冠秀[88]等研究南沙參和藜蘆合用對大鼠 CYP450 酶的作用發(fā)現(xiàn)，分為3組藥物：藜蘆組可以誘導(dǎo)大鼠 CYP2C9酶活性，南沙參組可以誘導(dǎo)大鼠 CYP1A2 酶，對 CYP3A4、CYP2C19幾乎無誘導(dǎo)作用；對藜蘆組而言，南沙參與藜蘆合用組抑制CYP3A4 酶，誘導(dǎo)CYP2C19 酶；對南沙參組而言，南沙參與藜蘆合用組抑制CYP2C19 酶。藜

64、蘆和北沙參合用時(shí)相比分別使用時(shí)引起體內(nèi)一些CYP酶的作用變化，可以推測出藜蘆的化學(xué)成分會改變機(jī)體對藥物的吸收、分布以及新陳代謝，兩者合用會產(chǎn)生彼此化學(xué)成分的聯(lián)系或者是發(fā)生化學(xué)變化，而這種推測還會進(jìn)一步得到研究和驗(yàn)證[89]。</p><p>　　王宇光等[90]對中藥藜蘆和人參兩者的合煎液與分煎后的混合液用超高效液相色譜-四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC/Q-TOF-MS）分析檢測，經(jīng)過分析得出，兩者合煎后藜蘆生物

65、堿成分溶出率升高，這與其毒性增強(qiáng)有很大關(guān)系。兩者合煎使人參皂苷的作用成分減少，提示兩者合用產(chǎn)生增毒減效的不良效果。 </p><p>　　楊亮[91]研究藜蘆和人參在1∶2.63 比例，合煎液與各自單煎混合液兩者的毒性差異非常顯著，合煎液在此比例時(shí)引起動物死亡是最多的。說明合煎時(shí)使毒性成分溶出增加，或者是藥物化學(xué)成分之間出現(xiàn)相互作用促使毒性增強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)藜蘆胺、芥芬胺在兩者合煎時(shí)量均增加，還有其他生物堿含量也增加；如

66、計(jì)米亭堿在合煎液與單煎混合液再煎液中的含量都有所上升，說明應(yīng)該是不同的化學(xué)成分間的反應(yīng)引起毒性成分含量升高。藜蘆和人參合用時(shí)，人參成分比例升高使總體出現(xiàn)的毒性效應(yīng)降低，藜蘆中溶出的生物堿類如藜蘆胺，計(jì)米亭堿等的成分越多，實(shí)驗(yàn)小鼠呈現(xiàn)的毒性越強(qiáng)。說明兩者同時(shí)煎煮使用引起的毒性效應(yīng)主要是藜蘆堿部分，提示配伍禁忌中人參量增多能降低藜蘆引起的毒性[92]。</p><p>　　梁愛葵[93]等研究藜蘆和三種中藥人參、西洋

67、參、三七合用，檢測藜蘆成分藜蘆定煎出量。用簡單、精準(zhǔn)、高靈敏性的反相高效液相色譜法進(jìn)行檢測，藜蘆和三者合煎得出的藜蘆定的量與藜蘆單獨(dú)煎煮得出的藜蘆定的量進(jìn)行對比，得出藜蘆和三者合煎均產(chǎn)生藜蘆定成分增加，為中藥配伍禁忌做出了科學(xué)依據(jù)。</p><p>　　李飛[94]研究藜蘆和丹參合用引起的毒性效應(yīng)的變化，當(dāng)藜蘆成分高于可以致實(shí)驗(yàn)動物L(fēng)D50的劑量時(shí)，藜蘆和丹參合煎其中的化學(xué)成分如藜蘆定的溶出率與單用藜蘆水煎的溶出

68、率相同或略高。同水平下，如果增加丹參的成分，藜蘆定等藜蘆的化學(xué)成分如偽介芬胺的煎出會隨之減少。提示兩者合用后藜蘆的有毒生物堿成分煎出率升高，可以作為藜蘆主要的毒效物質(zhì)參數(shù)。</p><p>　　張嫻勰等[95]探討藜蘆和白芍合用的毒性作用，發(fā)現(xiàn)兩者合用的毒性是與兩者的配比、兩者的用量有關(guān)，合用后產(chǎn)生的毒性為藜蘆毒性表現(xiàn)強(qiáng)，藜蘆配比升高則死亡率顯著提高，當(dāng)白芍配比升高毒性顯著下降。說明藜蘆、白芍結(jié)合使用不產(chǎn)生毒性增

69、強(qiáng)。</p><p>　　王艷麗[96]探討了藜蘆和細(xì)辛一起使用所引起的毒性作用，是兩者共同引起的，而藜蘆引起的毒性所占比例更高一些，合用時(shí)藜蘆分量增大引起的毒性不是直接表現(xiàn)出增強(qiáng)的現(xiàn)象。提示細(xì)辛中的化學(xué)成分有可能會抑制藜蘆毒性成分的增強(qiáng)。</p><p>　　李蕓[97]對九萬多張使用藜蘆的處方進(jìn)行總結(jié)分析，得出藜蘆針對“十八反”中的“反”藥進(jìn)行合用的處方數(shù)量在宋朝運(yùn)用最多。藜蘆的劑型多

70、使用散劑，并且不內(nèi)服僅外用。</p><p>　　1．6 藜蘆的構(gòu)毒關(guān)系研究</p><p>　　按照藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)引起生物活性的變化，可將藥物從宏觀來講分為非特異和特異性結(jié)構(gòu)藥物。非特異性結(jié)構(gòu)藥物的生物活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系主要是由這些藥物特定的理化性質(zhì)決定的。很多藥物的結(jié)構(gòu)與藥效關(guān)系之間有緊密聯(lián)系，藥物通過與細(xì)胞上的受體相結(jié)合發(fā)揮藥效作用，這些藥物的分子外形、分子基團(tuán)排列、官能團(tuán)布局、化學(xué)反應(yīng)

71、等都要與受體相適合才能起到相應(yīng)的作用。構(gòu)效關(guān)系的研究為新藥的開發(fā)和利用提供了有力的理論依據(jù)，并且取得了一定的成果。</p><p>　　脂溶性藜蘆生物堿，藜蘆定，是植物的電壓門控鈉離子通道的激動劑，是一種神經(jīng)毒素，通過核磁共振譜方法在低溫氯仿溶液相下進(jìn)行分析出其在疏水環(huán)境中的構(gòu)象。3-羧酸酯是產(chǎn)生神經(jīng)毒性所必不可少的構(gòu)象。羧酸酯的羰基氧原子與在C4上的羥基（4-OH）形成弱的分子內(nèi)氫鍵，松散地限制了藜蘆的3-藜蘆

72、酰基構(gòu)象和藜蘆定堿的3-當(dāng)歸?；サ慕Y(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，該羧酸酯的松散構(gòu)象對于限制藜蘆生物堿的神經(jīng)毒性有很重要的作用[98]。</p><p>　　Ai Y-N等人設(shè)計(jì)了相應(yīng)的大鼠骨骼肌編碼Nav1.4的基因突變第四域段第6節(jié)（ DIVS6 ）的模型肽，通過核磁共振分析模型肽和VTD（藜蘆堿）的復(fù)合體，獲得其相互作用的結(jié)構(gòu)信息。模擬進(jìn)行NMR滴定實(shí)驗(yàn)，也表明了VTD甾體骨架與DIVS6之間相互的表面疏水作用，發(fā)現(xiàn)VT

73、D的3位?；赡芘c大鼠骨骼肌Nav1.4型鈉離子通道蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅰ段6節(jié)和/或域IV段4節(jié)相互作用，激活鈉離子通道，引起神經(jīng)毒性[99]。</p><p>　　有學(xué)者研究藜蘆生物堿，用生物催化和半合成的方法得到化合物，評價(jià)了他們的藥效團(tuán)模型的生物活性。這些化合物可抑制人類前列腺惡性腫瘤PC-3細(xì)胞系的周期生長，繁殖和遷移的能力，建立出預(yù)初步的構(gòu)效關(guān)系。其結(jié)果，用HipHop-REFINE模塊組建的一個(gè)藥效學(xué)模型，并

74、且用ROC分析進(jìn)行了驗(yàn)證，以了解所需的生物活性的基本特征。這樣的模型可以應(yīng)用于對藜蘆生物堿的結(jié)構(gòu)修飾，發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)新的藜蘆生物堿相關(guān)的類似物，對各種HH-依賴性的惡性腫瘤的治療是有作用的[100]。</p><p>　　就目前國內(nèi)外對藜蘆甾體生物堿研究現(xiàn)狀來看，藜蘆堿的毒性與結(jié)構(gòu)之間是否存在和存在多大程度的關(guān)系研究甚少。人們對藜蘆的“有毒”研究有了一定了解，但是對于如何“降毒”、“減毒”的研究還沒有突破性進(jìn)展。&l

75、t;/p><p><b>　　1．7 本節(jié)小結(jié)</b></p><p>　　當(dāng)前的研究進(jìn)展可以看出，藜蘆生物堿有著廣泛的藥理作用和應(yīng)用領(lǐng)域，但由于其較高的生理和遺傳毒性明顯降低了其在臨床上的應(yīng)用。就目前國內(nèi)外對藜蘆甾體生物堿研究現(xiàn)狀來看,藜蘆堿的毒性與結(jié)構(gòu)之間關(guān)系研究甚少。人們對藜蘆的“有毒”研究有了一定了解,但是對于如何“降毒”、“減毒”的研究還沒有突破性進(jìn)展。<

76、/p><p>　　二 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)介紹</p><p>　　2．1 DNA損傷、檢測方法</p><p>　　DNA 是一種生物大分子，在細(xì)胞內(nèi)起著遺傳信息表達(dá)作用，同時(shí)把此信息傳遞給下一代，是細(xì)胞內(nèi)遺傳信息貯存的主要載體，也是遺傳工程和生物化學(xué)工程重要的研究對象。DNA是由2支平行的脫氧核苷酸鏈組成，其結(jié)構(gòu)是相反的方向的雙螺旋狀，由4種脫氧核苷酸彼此聚合形成的，

77、DNA上的遺傳信息是由脫氧核苷酸鏈上的堿基的種類、數(shù)目和順序排列所定的，堿基埋于DNA雙螺旋形成的溝內(nèi)，氫鍵連接堿基和雙螺旋結(jié)構(gòu)，維持了 DNA 雙鏈的穩(wěn)定性，同時(shí)保證正確傳遞DNA遺傳信息。</p><p>　　人類環(huán)境中有多種物理因素，化學(xué)因素，生物因素（如放射性元素，金屬及其化合物，有機(jī)染料，病毒和細(xì)菌等）會造成對DNA的損傷，如單、雙鏈的斷裂，雙鏈結(jié)構(gòu)的改變?nèi)琰c(diǎn)突變損傷和DNA 交聯(lián)。</p>

78、<p>　　神經(jīng)細(xì)胞DNA受損因素有自身因素、物理因素和化學(xué)因素，均導(dǎo)致體內(nèi)DNA結(jié)構(gòu)改變，包括DNA點(diǎn)突變、DNA雙鏈上核苷酸缺損、轉(zhuǎn)位、DNA核苷酸鏈斷開等。氧化應(yīng)激是各個(gè)組織細(xì)胞DNA損傷的重要因素之一[101，102]。毒性藥物主要通過引起氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷神經(jīng)細(xì)胞DNA，導(dǎo)致DNA堿基烷基化、堿基脫落、斷裂、交聯(lián)[103，104]。細(xì)胞DNA受損時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生一連串應(yīng)激反應(yīng)，如周期停滯、DNA自體修復(fù)甚至凋亡等，用來

79、維持基因組穩(wěn)定性。如DNA受損沒有被及時(shí)修復(fù)，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)DNA損傷累積，繼而使DNA遺傳信息的翻譯異常導(dǎo)致信息轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤。如帕金森病、脊髓側(cè)索硬化、毛細(xì)血管共濟(jì)失調(diào)，著色干皮病已明確證明是由DNA修復(fù)錯(cuò)誤引起的。而且腦組織DNA修復(fù)能力低，所以DNA修復(fù)系統(tǒng)缺陷導(dǎo)致DNA損傷的積累，最后引起神經(jīng)變性即神經(jīng)毒性[105-109]。</p><p>　　經(jīng)常用的DNA 損傷檢驗(yàn)對細(xì)胞DNA損傷之后的情況有良好的檢驗(yàn)效

80、果，對細(xì)胞DNA單、雙鏈的損傷和斷裂情況檢驗(yàn)效果很差。常見的方法有4種：微核法、觀察染色體變畸法、Ames檢驗(yàn)法和姐妹染色體交換法。彗星實(shí)驗(yàn)是一種檢驗(yàn)單個(gè)細(xì)胞DNA受損量多少的技術(shù)方法。細(xì)胞內(nèi)部的抗氧化防護(hù)系統(tǒng)被ROS（反應(yīng)性氧化物）反應(yīng)產(chǎn)物打破，導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和多種脂質(zhì)的破壞，引起細(xì)胞功能系統(tǒng)紊亂[110]。抗氧化防護(hù)系統(tǒng)產(chǎn)生的抗氧化劑有超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、巰基化合物和過氧化物酶，機(jī)體各種氧化反應(yīng)因子可以被這些酶去除，造成

81、的損傷也可以降低，細(xì)胞從而得到修復(fù)[111]。</p><p>　　2．2 SCGE 實(shí)驗(yàn)發(fā)展簡介</p><p>　　彗星實(shí)驗(yàn)的學(xué)名被稱作是單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)過程操作方法簡捷、起效快、強(qiáng)敏感性的一種檢測細(xì)胞DNA損傷技術(shù)。細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜、核膜由去垢劑和高濃度鹽混合液對細(xì)胞進(jìn)行裂解，對染色體內(nèi)多數(shù)蛋白組提取溶解出來，細(xì)胞核的主體上僅留有DNA存在，DNA由內(nèi)而外分散呈現(xiàn)一個(gè)近似圓

82、狀的halo結(jié)構(gòu)，DNA 被破壞越徹底，圓狀的結(jié)構(gòu)的范圍更廣，這是上世紀(jì)70年代Cook[112]等首次提出DNA 損傷的檢驗(yàn)技術(shù)。這之后兩年又有學(xué)者提出一種凝膠分析技術(shù)，是把以上步驟得到的個(gè)體分散細(xì)胞和瓊脂糖溶液組合到一起形成混合液，于磨砂的載玻片進(jìn)行鋪膠，之后進(jìn)行DNA的解旋和裂解，將鋪過膠的玻片泡在事先配好的新鮮的裂解細(xì)胞的溶液里，經(jīng)過一定時(shí)間后，取出進(jìn)行染色觀察和分析，把吖啶橙滴到玻片上，顯微鏡下會呈現(xiàn)兩種顏色的光，DNA的單、

83、雙鏈和AO混合作用發(fā)生紅色和綠色的光，由這兩種光的發(fā)光度的比來進(jìn)行測試DNA受損大小，這是Rydberg[113]對Cook的實(shí)驗(yàn)步驟和方法進(jìn)行的改進(jìn)，但由于對DNA受損敏感性不高沒有大范圍使用。后來又有學(xué)者Ostling[114]研究出一種更容易、簡便測量DNA受損的中性彗星實(shí)驗(yàn)的方法</p><p>　　上述幾種方法對DNA雙鏈?zhǔn)軗p檢測結(jié)果明顯，對DNA單鏈的檢測效果不顯著。現(xiàn)在多用的方法是在pH>13

84、.0的電泳緩沖液中進(jìn)行電泳步驟，pH>13.0時(shí)可以使RNA降解加速，減少對DNA損傷檢測的干擾，不僅可以檢測出DNA雙鏈損傷，還可以檢測DNA單鏈?zhǔn)軗p，敏感性得到增強(qiáng)。還可以檢測由遺傳毒性物質(zhì)引起的堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)和檢測DNA單鏈損傷要比雙鏈損傷能力要大得多，比例可達(dá)1/2000[115-117]。此之后眾多的研究者對上述彗星試驗(yàn)的條件一直在摸索前進(jìn)，使此方法在細(xì)胞學(xué)和蛋白質(zhì)研究方面有了很大的應(yīng)用，如DNA受損的機(jī)理的深入研究、藥

85、物作用于機(jī)體和蛋白質(zhì)結(jié)合研究、檢驗(yàn)遺傳毒物研究等[118]。</p><p>　　2．3 SCGE實(shí)驗(yàn)方法</p><p>　　目前單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)主要包括兩種方法：</p><p>　　（1）接近pH7.4的單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞膜、核膜的裂解使用pH>13.0的堿性裂解液，電泳時(shí)用近pH7.4的電泳緩沖液，DNA雙鏈不受影響，因此用近pH7.4電泳條件

86、檢驗(yàn)DNA雙鏈?zhǔn)軗p程度，還可以檢測一些植物細(xì)胞的受損大小。但不能監(jiān)測到單鏈DNA的損傷[114]。</p><p>　?。?）當(dāng)pH>13.0的單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)增強(qiáng)了對DNA受損和檢驗(yàn)的敏感性，其是在堿性條件下對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞膜、核膜的裂解、雙鏈DNA打開、電泳，DNA碎片隨電流移動離開核骨架，對DNA單雙鏈斷裂均可以監(jiān)測，還可以對堿性不穩(wěn)定點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測[118]，此由Singh[115]和Olive[120

87、]等提出。</p><p>　　當(dāng)前，國內(nèi)外所指的單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)通常是用堿性電泳條件的操作方法，而且增加了不同的科學(xué)技術(shù)，操作步驟大致相同，實(shí)驗(yàn)條件日益成熟和靈活性增高。</p><p>　　2．3．1 細(xì)胞來源</p><p>　　可以進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞有很多種，有動物界和植物界細(xì)胞均可，例如有動物類小鼠、大鼠、兔子等的腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肺泡細(xì)胞、

88、肝細(xì)胞等，植物類的葉片細(xì)胞、種子表皮細(xì)胞等[121]。幾年來又出現(xiàn)用于單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的有人頰粘膜、植物種子細(xì)胞等，人類外周血細(xì)胞是最常用的，還有V79細(xì)胞、CHOK1 細(xì)胞、Hela細(xì)胞、MeWo細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞。不同的細(xì)胞使用的培養(yǎng)基，裂解細(xì)胞的緩沖液和電泳液均要進(jìn)行選擇，最終確定適宜的實(shí)驗(yàn)條件。Mckelvey－Martin[122-124]提取出原代細(xì)胞十多種，培養(yǎng)出正常的組織細(xì)胞20余種。</p><p&g

89、t;　　2．3．2 瓊脂糖凝膠載玻片的制備</p><p>　　制備合適濃度的瓊脂糖凝膠載玻片對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響很大，關(guān)系到膠體與載破片的粘附力，還關(guān)系著細(xì)胞與瓊脂糖凝膠的結(jié)合力，并且必須保證顯微鏡下觀察的清晰度。若瓊脂糖濃度低則導(dǎo)致其容易從載玻片上脫落而導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)的失敗。瓊脂糖濃度太高粘附力太強(qiáng)則會影響鋪膠狀態(tài)，造成膠面不平整，出現(xiàn)一邊厚一邊薄的情況，而且影響受損細(xì)胞DNA的移動，呈現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。細(xì)胞結(jié)合在膠面

90、上的濃度太高則會導(dǎo)致鏡下觀察細(xì)胞多處重合，造成無法進(jìn)行DNA受損的圖像分析，所以鏡下觀察細(xì)胞應(yīng)該是均勻分散，單個(gè)獨(dú)立狀態(tài)才是最佳。所以適宜濃度的瓊脂糖凝膠體對實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行是很重要的，確保膠體牢固于載玻片、與細(xì)胞均勻混合、不影響DNA移動。</p><p>　　單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)用的玻片制備方法多樣。起先是把鋪好的載玻片放入冰箱進(jìn)行冷凍保存，這樣可以提高膠面與載玻片的粘著力。后來，國外發(fā)明了一種專門用于單細(xì)胞凝膠

91、實(shí)驗(yàn)的載玻片，研究者們只要進(jìn)行含有細(xì)胞的第二層鋪膠步驟即可，更方便快捷。但是這種載玻片市場價(jià)格在幾千元不等，實(shí)驗(yàn)消耗量較大，所以很多研究者還是經(jīng)常使用全磨砂的載玻片，不僅價(jià)廉，而且也比較方便，凝膠與磨砂面有較強(qiáng)的粘著力，如果膠體濃度適宜，膠面不會有脫落現(xiàn)象發(fā)生。原則上制備單細(xì)胞凝膠電泳載玻片需要三層膠體，第一層是鋪底層，是為了第二層與細(xì)胞混合的膠面均勻粘附，第三層是為了保證第二層的平整性和完整性。具體方法如下：</p>&

92、lt;p>　　第一層：磷酸鹽緩沖液為溶劑制備0.5% 的NMP膠液，高溫融解，精密吸取100μl此膠液，迅速移至載玻片的全磨砂一面，加蓋玻片，放入冰箱冷藏4攝氏度下15 min使膠液膠面凝結(jié)一起。第二層：第一層膠面制成后，揭掉蓋玻片放置待用。磷酸鹽緩沖液為溶劑制備0.5%LMP膠液，放置于37攝氏度水浴數(shù)分鐘待用，細(xì)胞混懸液與LMP膠液用同等比例制成混合液。吸出100μl混合液，蓋蓋玻片，放入冰箱冷藏4攝氏度下15 min。第三層

93、：15min后，取出玻片，揭去蓋玻片，再從NMP膠液吸出100μl加入到載玻片，蓋蓋玻片，放入冰箱冷藏4攝氏度下15 min。</p><p>　　2．3．3 細(xì)胞核裂解</p><p>　　待第二層細(xì)胞混懸液的瓊脂糖凝膠在載玻片上冷凝后，揭去蓋玻片，將其浸入新鮮配制的細(xì)胞裂解液中，4攝氏度低溫冷藏環(huán)境下進(jìn)行裂解。細(xì)胞裂解液要事先配好置于低溫冷藏，目的是為了電泳玻片上的凝膠保持穩(wěn)定，也使瓊

94、脂糖凝膠在裂解過程中不會脫落。</p><p>　　裂解時(shí)間長短根據(jù)細(xì)胞不同會有所差異，時(shí)間可以數(shù)分鐘到幾周，經(jīng)過多次的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出具體的試驗(yàn)條件。細(xì)胞裂解過程的目的是把細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)破壞，這樣斷裂的DNA 斷片在電泳的作用下從核中移動出來。</p><p>　　裂解液配方：2.5 mol·L-1氯化鈉，100 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉，10mmol

95、3;L-1Tris，1%肌氨酸鈉，10%二甲基亞砜，1%曲拉通，用氫氧化鈉調(diào)pH至10。10%二甲基亞砜的作用是保護(hù)細(xì)胞DNA不受自由基作用造成的額外受損。</p><p>　　裂解液的成分能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)大部分非DNA物質(zhì)分散到裂解液中，細(xì)胞裂解液使蛋白質(zhì)和DNA斷開連接，擴(kuò)散到裂解液中，還使蛋白質(zhì)變性。McKelvey-Martin分析出不加肌氨酸鈉只用曲拉通也能把細(xì)胞膜裂解。當(dāng)然，細(xì)胞類型不

96、同，加入的裂解液成分也會有所差異[122]。</p><p>　　2．3．4 堿解螺旋</p><p>　　低溫裂解之后鑷子取出玻片，注意在避光或者暗光下操作，用雙蒸水簡單漂洗2-3次，注意要輕緩以免凝膠脫落，放入電泳槽中，緩慢加入低溫的堿性電泳液 (1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉，300 mmol·L-1氫氧化鈉，測得pH>13) ，液面高度在高于玻片3m

97、m處即可，低溫下使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)打開，時(shí)間 20-50 min。</p><p>　　堿性條件下解旋是為了：破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，使DNA 雙鏈變?yōu)閱捂湥划?dāng)pH>13時(shí)，能夠降解RNA，最終形成-2’核苷酸和-3’核苷酸，減少 RNA 對試驗(yàn)結(jié)果的干擾。經(jīng)過裂解，然后取出載玻片，低溫蒸餾水漂3min/次，漂3 次，目的是洗去載玻片上遺留的小部分裂解液。在暗光下使DNA充分解旋約20-50min，如此可以在電

98、泳時(shí)容易遷移。</p><p><b>　　2．3．5 電泳</b></p><p>　　電泳條件：溫度低于15℃，電壓在 18-25V之間，電流200-300 mA ，時(shí)間30-50min，保持電壓恒定，調(diào)節(jié)玻片與液面距離改變電流大小，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，具體實(shí)驗(yàn)條件需要摸索，電壓和電流大小調(diào)整好，彗星實(shí)驗(yàn)中的電泳與常規(guī)的DNA電泳相比會受更多因素影響，比如植物細(xì)胞核種類

99、、細(xì)胞核大小、裂解時(shí)間、DNA 解旋程度等，所以在實(shí)驗(yàn)中要注意實(shí)驗(yàn)操作條件的一致性[125]。同一批次的實(shí)驗(yàn)要用同樣的條件，包括使用的電泳儀和電泳槽也要相同，從而保證實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差相同。放置玻片于電泳槽要符合隨機(jī)性。張遵真[125]對單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的方法和條件進(jìn)行了研究，系統(tǒng)地對比發(fā)現(xiàn)了5個(gè)方面與對DNA 損傷電泳移動范圍的關(guān)系，得出電泳的電流大小和電泳時(shí)的溫度與檢測DNA損傷關(guān)系不大，然后是細(xì)胞裂解時(shí)間、堿性條件解螺旋時(shí)間對與檢測

100、DNA損傷有些關(guān)系，主要是電泳時(shí)的電壓和時(shí)程的長短與鏡下觀察到的DNA損傷關(guān)系密切。</p><p>　　2．3．6 中和與染色</p><p>　　堿性環(huán)境電泳過后，鑷子夾出凝膠載玻片，加入中性的緩沖液進(jìn)行中和（Tris-HCl 0.4mol/L，HCL調(diào)pH7.4），一般中和3次，15min/次[126]。具體中和次數(shù)依照具體實(shí)驗(yàn)操作條件而定，可以適當(dāng)?shù)脑黾雍蜏p少。中和之后放在避光的盒

101、子里，低溫冷藏環(huán)境不可長時(shí)間放置，最好一周內(nèi)進(jìn)行鏡下閱片[127]。有學(xué)者稱中和之后可以浸泡至甲醇或乙醇溶液，避光晾干，使玻片脫水，干燥，如此凝膠體不易變質(zhì)，保存時(shí)間長些，讀取時(shí)間范圍寬裕。自然晾干后的凝膠包含的細(xì)胞DNA更便于染色，對鏡下觀察清晰有所幫助[128]。</p><p>　　經(jīng)常使用的熒光染色劑有EB、YOYO－1、4， 6－二脒基－2－苯基吲哚、Sybrgreen、吖啶橙。EB是常用的，其是一種能

102、夠進(jìn)入到DNA鏈間的小溝內(nèi)，顯示熒光較強(qiáng)，EB較易與DNA雙鏈結(jié)合。使用吖啶橙染色時(shí)，雙鏈的DNA在鏡下看到有熒光顯示綠色，RNA、細(xì)胞核仁和DNA單鏈在鏡下熒光顯示為紅色。DAPI能與DNA鏈的主溝結(jié)合，DNA雙鏈的組成確定熒光染色的強(qiáng)弱，染色時(shí)間在20min以內(nèi)，要進(jìn)行快速閱片，如果時(shí)間過長會導(dǎo)致熒光褪色。染色劑的選擇是根據(jù)細(xì)胞種類、染色劑的使用性能還有顯微鏡決定的。Tebbs[129]在一些熒光染色劑中加抗褪色劑能極大減慢染料褪色

103、時(shí)間，同一張玻片能多次觀察。Kizilian[130]研究出可以使用硝酸銀進(jìn)行染色，單細(xì)胞凝膠電泳圖可以在其無需熒光條件下的顯微鏡可看出。趙蓉[131]等研究出銀染色法，此法方便并且價(jià)低，無熒光顯微鏡但又需要做單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的研究者可采用此法。上述方法都應(yīng)遵循一個(gè)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則，一定要保證實(shí)驗(yàn)的可靠性。</p><p>　　2．3．7 閱片分析</p><p>　　顯微鏡閱片和記錄之前，所有

104、載玻片都應(yīng)隨機(jī)編碼，陽性和陰性也在內(nèi)。每個(gè)載玻片記錄50 個(gè)細(xì)胞，要有代表性地選擇彗星圖，可以代表整個(gè)載玻片觀測到的圖。不讀取玻片邊緣和有氣泡區(qū)域，因?yàn)檫@邊緣和有氣泡的區(qū)域DNA損傷比較嚴(yán)重。通常測量單細(xì)胞DNA損傷需要目測和機(jī)測相結(jié)合進(jìn)行分析，人為的直觀檢驗(yàn)DNA損傷是在過去運(yùn)用比較多，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有很多可供選擇的彗星圖像分析軟件，試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析可以進(jìn)行電腦分析計(jì)算。免費(fèi)的單細(xì)胞凝膠電泳分析軟件有CASP[132]，有多個(gè)測量