喹噁啉類在大鼠和豬肝微粒體中脫氧速率與肝細(xì)胞中毒性的研究.pdf

1、喹噁啉類是化學(xué)合成的具有抗菌、促生長作用的動物專用藥，包括卡巴氧、喹乙醇、喹賽多、喹烯酮和乙酰甲喹等。因毒副作用，卡巴氧和喹乙醇已被禁止或限制使用。我國相繼批準(zhǔn)了乙酰甲喹和喹烯酮的使用，并正在開發(fā)安全的喹賽多等同類產(chǎn)品。喹噁啉-N-一氧化物的毒性比喹噁啉-N1,N4-二氧化物低，完全脫氧的喹嗯啉無毒性，因此喹噁啉-N1,N4-二氧化物脫氧速率越快，毒性喪失越快。喹嗯啉類母環(huán)結(jié)構(gòu)完全相同，都會發(fā)生相同的N→O基團(tuán)還原反應(yīng)，生成脫氧代謝物。

2、不同化合物由于側(cè)鏈不一樣，會對脫氧速率產(chǎn)生影響。脫氧快慢存在明顯差異，這種差異是否與其脫氧速率快慢相關(guān)尚無直接的研究證據(jù)。此外，研究表明，含有N-N-二氧基團(tuán)的化合物在脫氧的同時會產(chǎn)生超氧陰離子和OH自由基，導(dǎo)致DNA損傷、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡等氧化應(yīng)激毒性反應(yīng)。喹噁啉類是否會產(chǎn)生類似的毒性反應(yīng)尚值得探討。因此為了揭示喹噁啉類脫氧速率與毒性的關(guān)系，進(jìn)一步研究喹噁啉類的脫氧速率與氧化應(yīng)激毒性關(guān)系是非常必要的。
　　 本課題通過體外

3、研究法探研了喹噁啉類藥物在肝微粒體中的脫氧速率和在原代肝細(xì)胞中的氧化應(yīng)激毒性，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合實驗室前期研究結(jié)果深入分析了脫氧速率與主要毒性指標(biāo)之間的相關(guān)性，為闡明喹嗯啉類的毒性機(jī)理和毒性差異提供科學(xué)依據(jù)。
　　 采用差速離心法制備大鼠和豬肝微粒體，喹噁啉類與微粒體在低氧和有氧條件下37℃孵育，用LC/MS-ITTOF鑒定脫氧產(chǎn)物，HPLC法進(jìn)行相對定量，比較了喹噁啉類在肝微粒體孵育體系中脫氧速率，并考察了NADPH和NADH兩

4、種輔酶對還原反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，在輔酶NADPH和低氧條件下：喹賽多、喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮在大鼠肝微粒體中的脫一氧生成速率分別為：1.74、1.94、1.99、5.48和20.81min，脫二氧生成速率分別為：35.36、43.86、231、67.94和630min；在豬肝微粒體中脫一氧生成速率分別為1.93、2.16、2.36、6.07和27.02min,脫二氧生成速率分別為：36.28、44.14、223.55、72.

5、19和693min。在輔酶NADH和低氧條件下，喹賽多、喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧、喹烯酮在大鼠肝微粒體中的脫一氧生成速率分別為5.38、8.51、9.16、27.61和51.33min；豬肝微粒體中脫一氧生成速率分別為6.35、13.54、20.69、29.24和113.61min。在輔酶NADH和低氧條件作用下，大鼠肝微粒體中脫二氧產(chǎn)物很少，豬中未檢測到脫二氧產(chǎn)物；在有氧條件下通過HPLC也檢測不到脫二氧產(chǎn)物。此類藥物脫氧具有很強(qiáng)的低

6、氧偏好，低氧條件下脫氧產(chǎn)物濃度比有氧脫氧產(chǎn)物濃度要高6～10倍左右。綜上所述，五種喹噁啉類藥物脫一氧生成速率為喹賽多＞喹乙醇＞乙酰甲喹＞卡巴氧＞喹烯酮，脫二氧生成速率為喹賽多＞喹乙醇＞卡巴氧＞乙酰甲喹＞喹烯酮。
　　 采用組織消化法制備原代肝細(xì)胞，分別與五種喹噁啉類藥物在5％CO2，37℃孵育4h后，染毒劑量為5μmol/L,25μmol/L，50μmol/L，同時設(shè)置空白對照組和溶劑對照組。通過測定細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(LD

7、H)和細(xì)胞胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)含量變化來反應(yīng)氧化應(yīng)激毒性。結(jié)果表明，與空白對照組相比，五種藥物均可以導(dǎo)致LDH上升和GSH下降，SOD先上升后下降，具有劑量依賴性，隨劑量增大毒性增大。喹烯酮5μmol/L染毒組導(dǎo)致SOD顯著上升(p＜0.05)。乙酰甲喹和喹烯酮染毒濃度大于25μmol/L時導(dǎo)致SOD和GSH下降極顯著(p＜0.01)、LDH上升極顯著(p＜0.01)，喹烯酮變化明顯?？ò脱跞径緷舛却笥?5μ

8、mol/L時導(dǎo)致SOD和GSH顯著下降(p＜0.05),LDH顯著上升(p＜0.05)。喹乙醇25μmol/L時導(dǎo)致LDH顯著上升(p＜0.05)，50μmol/L時LDH上升極顯著(p＜0.01)。喹賽多在濃度50μmol/L時，SOD、LDH和GSH變化才表現(xiàn)出顯著差異(p＜o(jì).05)。由此看出喹烯酮毒性和乙酰甲喹毒性較大，其次是卡巴氧和喹乙醇，喹賽多毒性最小。
　　 采用兩個變量相關(guān)分析法，分析了不同條件下脫一氧和脫二氧的

9、生成速率與LD50、NOAEL、SOD、GSH和LDH之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，喹賽多、喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮脫一氧和脫二氧生成速率與LD50、NOAEL、GSH和SOD之間呈負(fù)相關(guān)，與LDH呈正相關(guān)，說明脫氧越快，毒性越??；脫一氧生成速率與LD50呈實相關(guān)(r＜0.5)，與體外氧化應(yīng)激毒性呈顯著相關(guān)(r≈0.5)，脫二氧生成速率與LD50呈顯著實相關(guān)(r＞0.5)，與體外氧化應(yīng)激毒性呈高度相關(guān)(r＞0.8)。可以看出，脫二氧生