固氮內(nèi)生菌HMLR8和HMLR13對(duì)水稻的促生效應(yīng)的研究.pdf

1、通過表面消毒，組織碾碎，汁液涂布無氮培養(yǎng)基的方法從稗草根中分離到內(nèi)生固氮菌18株，莖中分離到內(nèi)生固氮菌17株。
　　 經(jīng)回接水稻實(shí)驗(yàn)后，通過形態(tài)學(xué)和分子鑒定技術(shù)比較篩選得到兩株能侵染水稻中花11同時(shí)促進(jìn)水稻生長的菌株HMLR8和HMLR13。通過生理生化實(shí)驗(yàn)及16S
　　 rDNA測(cè)序比較得出它們分別為Klebsiella oxytoca和Roseatelesdepolymerans。PCR方法擴(kuò)增nifH基因和乙炔還原

2、法測(cè)定固氮酶活性證明了HMLR8和HMLR13的固氮性質(zhì)。用改良的Do氏培養(yǎng)基培養(yǎng)HMLR8和HMLR13，測(cè)到它們的固氮酶活性分別為1721.11nmolC2H4. ml-1·h-1和204.68nmolC2H4·ml-1·h-1。通過測(cè)定不同碳源條件下HMLR13的固氮酶活性發(fā)現(xiàn)HMLR13在以甘油為唯一碳源時(shí)固氮酶活性最高，達(dá)到406.5593nmolC2H4ml-1h-1。
　　 利用Roseatelesdepolyme

3、ran光捕捉器操縱子上的一段特異序列ORF077，為HMLR13設(shè)計(jì)了一對(duì)種特異性引物，并初步驗(yàn)證了其特異性，同時(shí)用接種HMLR13的水稻組織提取細(xì)菌DNA擴(kuò)增得到正確的特異條帶，為檢測(cè)RoseatelesdepolymeransstrainHMLR13在環(huán)境中的存在及宿主范圍提供了一種更為簡便的方法。
　　 通過不同濃度藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)的梯度篩選方法，得到具有100μg/mL利福平抗性的HMLR8和HMLR13菌株，以此測(cè)定HM

4、LR8和HMLR13在水稻組織內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)。研究結(jié)果表明在蘸根接種時(shí)，剪根和不剪根兩種條件下，兩株菌均能正常侵染水稻。其中HMLR13在水稻根內(nèi)的定殖數(shù)量在第5天達(dá)到最大，約為6.0×106cfu/gFW，HMLR8在水稻根內(nèi)的定殖數(shù)量在第10天時(shí)達(dá)到最大，為5.9×106cfu/gFW。這表明HMLR8在水稻根內(nèi)的定殖能力強(qiáng)于HMLR13。實(shí)驗(yàn)還表明在接種3天后才在莖中檢測(cè)到HMLR8和HMLR13的存在，并且它們的數(shù)量從接種后第3天

5、到第14天一直呈上升趨勢(shì)。
　　 應(yīng)用接合轉(zhuǎn)移的方法對(duì)HMLR13進(jìn)行g(shù)fp分子標(biāo)記，限菌條件下回接無氮水稻培養(yǎng)基培養(yǎng)的水稻，激光共聚焦顯微鏡觀察其在水稻根莖葉組織中的分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HMLR8和HMLR13在水稻根，莖和葉的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙都有分布，且HMLR13和HMLR8的纖維素水解酶和果膠水解酶活性協(xié)助了它們?cè)谒窘M織內(nèi)的定殖和遷移。實(shí)驗(yàn)還表明當(dāng)用HMLR8和HMLR13接種用無氮半固體水稻培養(yǎng)基培養(yǎng)的水稻時(shí)，它們?cè)谒?/p>

6、稻根表有聚集附著現(xiàn)象，并隨著根的生長向培養(yǎng)基內(nèi)部移動(dòng)。同時(shí)，接種了HMLR8和HMLR13的水稻的根毛要明顯多于對(duì)照。測(cè)定接種了HMLR8和HMLR13的水稻植株的固氮酶活性，結(jié)果分別為0.359nmolC2H4·mgFW-1·h-1和0.760.359nmolC2H4·mgFW-1.h-1，這表明水稻組織內(nèi)的微環(huán)境更適合HMLR8固氮酶活性的表達(dá)。
　　 盆栽實(shí)驗(yàn)中，在水稻分別接種HMLR8和HMLR13后60天收獲植物分別測(cè)

7、定植株的鮮重，干重，根長，株高和植株總氮含量等數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HMLR8和HMLR13均能不同程度地提高水稻生物量、根長、芽長和植株氮含量。HMLR8根長比對(duì)照高出115.58％，株高比對(duì)照高出47.69％，鮮重比對(duì)照高出140.14％，干重比對(duì)照高出162.91％，植株含氮量比對(duì)照高出241.87％。HMLR13根長比對(duì)照高出95.86％，株高比對(duì)照高出27.39％，鮮重比對(duì)照高出61.47％，干重比對(duì)照高出63.04％,植株含氮量