源自內(nèi)生真菌的倍半萜類新穎高效抑菌化合物的衍生合成與生物活性研究.pdf

1、近年來，基于天然產(chǎn)物的新穎殺菌劑創(chuàng)制研究層出不窮，像源自于微生物的代謝產(chǎn)物井岡霉素，作為農(nóng)用殺菌劑多年來對水稻紋枯病的防治效果一直很好。Stroblurins類殺菌劑也是以天然產(chǎn)物為母體經(jīng)過結構修飾，創(chuàng)制出的一系列高效、廣譜、安全的殺菌劑，成為當今殺菌劑市場最活躍、最有發(fā)展?jié)摿Φ囊活愋缕贩N。
　　 木霉菌是植物內(nèi)生真菌系列中很重要的一類生防菌，木霉菌的廣泛應用與其主要代謝產(chǎn)物木霉菌素廣譜高效的抑菌活性是分不開的。為了更細致的研究

2、木霉屬系列代謝產(chǎn)物，更好的發(fā)揮木霉菌的用途，也為了尋求更優(yōu)異的結構骨架或新穎先導結構，本文以南方紅豆杉Taxus chinesis var.mairei內(nèi)生真菌紫杉木霉Trichoderma taxi sp.nov.菌的代謝產(chǎn)物木霉菌素為先導化合物，根據(jù)活性亞結構連接、生物等排性原理等方法，對此類倍半萜結構進行詳細的結構修飾，細致的生物活性篩選，具體研究內(nèi)容及結果如下：
　　 1、系統(tǒng)總結了內(nèi)生真菌中單端胞霉烯類化合物的研究現(xiàn)狀

3、，木霉菌生物防治應用、木霉菌素的發(fā)酵、結構、活性，以及細菌、真菌及高等生物都具有的P450酶-CYP51酶的研究進展及其作為靶標來創(chuàng)制篩選新型抑菌活性物的應用前景。
　　 2、首先對木霉菌素倍半萜結構進行“破壞性”的骨架改變，結合生物活性測定，篩選確定了其重要的抑菌活性基團：△-9，10(雙鍵)、12，13-環(huán)氧結構、C4位的乙酰基，C4位的立體構型：R構型的比S構型的活性好很多。
　　 3、分別在C4位、C8位，C9位

4、和環(huán)氧位置進行衍生設計與合成，合成了化合物102個，其中88個是新化合物。所有化合物結構都經(jīng)過1H NMR、MS，部分經(jīng)過13C NMR確證結構，每章代表性化合物2.5、2.8、32f、32d、42e和5.1通過X-ray衍射，獲得其晶體結構，進一步確定了其化學結構，為后續(xù)的小分子化合物與大分子靶標對接打下良好的基礎。
　　 4、以《農(nóng)藥生物活性測定標準操作規(guī)范(SOP)》為準則，通過生物活性測定，篩選出系列抑菌活性良好的新化合

5、物：在50μg/mL的濃度下，木霉菌素C4位衍生物中，化合物31e、31f和35a對稻瘟病菌的抑制活性明顯比木霉菌素原藥2.1高，都達到100％抑制率；對黃瓜灰霉病菌的抑制活性：化合物31e、31f和2.1都是100％，35a也達到94.3％的抑制率；2.1對水稻紋枯病菌的活性最高為100％，31e、31f、35a分別為95.5％、92.5％、95.5％；化合物31j和31k對赤霉的抑制率都為100％；化合物31e、35a和木霉菌素2.

6、1對油菜菌核病菌的抑制率為87.7％、86.6％、95.9％。C8位衍生物中，化合物42g對油菜菌核病菌和稻瘟病菌的抑制活性明顯都比木霉菌素原藥2.1高，抑制率都為100％。C9衍生物中化合物5.1對灰霉菌、稻曲病菌的抑制率為100％。
　　 進一步的初篩、復篩表明：化合物31e、35a、2.1對黃瓜灰霉病菌的EC50值分別4.23、2.99和0.45μg/mL?；衔?1e、35a、2.1對油菜菌核病菌的EC50值分別為10.

7、86、12.06、2.20μg/mL。木霉菌素2.1對小麥赤霉病菌的EC50值為5.60μg/mL?；衔?1e、31f和35a對稻瘟病菌也表現(xiàn)出良好的生物活性，EC50分別為6.31、12.9和6.00μg/mL，均超過母體木霉菌素的活性。31e、35a、2.1和商品化藥劑丙環(huán)唑?qū)λ炯y枯病菌的EC50值分別為2.48、4.18、0.72和6.45μg/mL，與丙環(huán)唑的毒效比分別為2.60、1.54、8.96。
　　 化合物4

8、2g對油菜菌核病菌的EC50值分別1.77μg/mL，高于母體木霉菌素。木霉菌素原藥2.1、新化合物42g對稻瘟病病菌的EC50值分別為39.47和0.74μg/mL。化合物42g對稻瘟病菌的抑制活性遠超過木霉菌素原藥，與現(xiàn)今普遍應用的防治稻瘟病菌的殺菌劑咪鮮胺(EC50=0.98μg/mL)相當，比常規(guī)的三環(huán)唑和甲基硫菌靈活性要高。另外42g對水稻紋枯病菌的EC50值分別為3.58μg/mL，雖然沒有母體木霉菌素的抑制率高，但是也超過

9、了商品化藥劑丙環(huán)唑(EC50為6.45μg/mL)。42g對水稻稻曲病菌的抑制活性較好，EC50為1.48μg/mL，超過木霉菌素2.1的EC50(2.11μg/mL)，比常用的防治稻曲病的常用殺菌劑咪鮮胺(EC50為0.76μg/mL)略低一些。
　　 合成C8位衍生物烯丙位氧化過程中得到了另外一個產(chǎn)物，經(jīng)1HNMR、MS、X-ray結構確證為C9醛木霉(5.1)，經(jīng)生物測定新穎倍半萜醛化合物5.1對多種植物病原菌活性優(yōu)異，對

10、黃瓜灰霉的抑制中濃度(EC50)為0.48μg/mL，接近木霉菌素的抑制中濃度0.45μg/mL；對水稻稻瘟病的EC50為11.820μg/mL，高于甲基托布津(EC50為36.72μg/mL)，對水稻紋枯病菌的活性EC50為7.40μg/mL，雖然低于木霉菌素母體的活性，但也與丙環(huán)唑(EC50=6.45μg/mL)、井岡霉素(EC50為1.26μg/mL)在同一個活性數(shù)量級。尤其是對于水稻稻曲病菌的抑制活性很高，EC50為0.80μg

11、/mL，與現(xiàn)在市場上暢銷的殺菌劑咪鮮胺(EC50為0.76μg/mL)非常接近，高于母體木霉菌素一個數(shù)量級，在稻曲病防治上有一定的開發(fā)價值。
　　 5、應用兩種不同軟件計算log p，比較相互結果發(fā)現(xiàn)：C4衍生物中活性好的化合物logP值基本上在2.2到3.2之間，C8位衍生物中對稻瘟病抑制活性好的化合物42g的logP值基本上在3.6-4.0之間。并且通過比較發(fā)現(xiàn)用ALOGPS2.1預測計算一些同分異構體化合物的logP更為精

12、確一些。
　　 6、因為活性化合物5.1在水稻重要病害-稻曲病、紋枯病和稻瘟病防治上顯示出良好的活性，化合物42g對水稻稻瘟病防治具有優(yōu)異的活性，所以進一步研究了其對水生生物-典型大型蚤和柵藻的毒性，通過DS軟件預測與實際檢測，結果顯示42g對大型蚤的毒性都是低毒級別，化合物5.1對大型蚤的毒性預測值與實際測定值都為中等毒性級別，對柵藻的毒性測定值為高毒。所以新穎化合物42g和5.1都可以作為二級先導化合物進一步優(yōu)化開發(fā)或者直接

13、作為潛在活性物用于開發(fā)新型倍半萜類廣譜高效殺菌劑，具有進一步研究開發(fā)的價值。
　　 7、初步研究了活性小分子與CYP51酶的互作機制.采用計算機模擬計算，重點選擇細菌、真菌、高等動植物中都很重要的P450家族中CYP51為靶標對象，采用同源建模，選擇基因序列最接近的模板建立了灰霉的CYP51蛋白結構-BCCYP51酶，利用Profiles-3D得分值186，應用Autodock4和DS Libdock對活性化合物分別進行分子對接

14、.結果發(fā)現(xiàn)，同樣對灰霉模建蛋白CYP51進行對接，不同軟件結果一樣，母體2.1與活性物5.1在活性口袋中的作用方式與作用位點非常相似，主要結合于HEME所處的活性口袋中央，環(huán)氧乙烷指向狹長口袋。小分子的乙酰基和金屬鐵相互作用。HEME以及金屬離子是抑制劑結合的識別作用點。但是42g與5.1的結合方式不同，苯環(huán)疏水作用于狹長口袋，倍半萜結構中主要是C8位-丙烯酸酯中的酰基與HEME中的金屬鐵直接作用。通過小分子化合物與大分子靶標之間的分子