BmMITE-2l轉(zhuǎn)座元件的適應(yīng)性進(jìn)化及對(duì)插入位點(diǎn)附近基因的影響.pdf

1、考古證據(jù)表明，家蠶由大約5，000年前的野桑蠶經(jīng)歷人工馴化而來。在古代，中國(guó)把蠶視為國(guó)寶，為了保護(hù)蠶絲生產(chǎn)的秘密，嚴(yán)厲禁止走私蠶或蠶卵到其它國(guó)家。這項(xiàng)禁令持續(xù)了幾千年，直到養(yǎng)蠶技術(shù)傳播到日本、中東及歐洲一些國(guó)家。作為鱗翅目昆蟲的代表，家蠶是至今已知的唯一被人類完全馴化的經(jīng)濟(jì)類昆蟲，也是進(jìn)行遺傳學(xué)研究的好材料。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)家蠶資源共有約1000個(gè)品系。根據(jù)地理位置，歷史上人為的將家蠶分為中系、日系、歐系和熱帶系統(tǒng)四大系統(tǒng)，同時(shí)野外也

2、存在著豐富的野桑蠶資源，這為我們研究家蠶與野桑蠶之間的遺傳多態(tài)性提供了有利的條件。西南大學(xué)蠶學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)研究所保存的家蠶基因庫(kù)是目前世界上保存系統(tǒng)最多的基因庫(kù)，這些家蠶品系為研究家蠶的適應(yīng)性進(jìn)化提供了豐富的遺傳材料。
　　 隨著近年來大規(guī)模的基因測(cè)序的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)真核生物基因組中含有大量的重復(fù)序列，因此要研究真核生物基因組的進(jìn)化和起源，就必須研究轉(zhuǎn)座元件對(duì)宿主基因組的影響。轉(zhuǎn)座元件是一種重復(fù)的DNA片段，能夠在基因組中隨機(jī)移動(dòng)，

3、進(jìn)而改變宿主基因組的結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)轉(zhuǎn)座元件跳躍而插入到某個(gè)功能基因時(shí)，就可能誘發(fā)產(chǎn)生突變，突變是沒有方向的，對(duì)于單個(gè)個(gè)體來說大多數(shù)突變可能是有害的，而對(duì)于整個(gè)物種來說突變能夠產(chǎn)生大量的遺傳變異來適應(yīng)多變的外界環(huán)境，進(jìn)而加速物種的進(jìn)化[1]。
　　 家蠶基因組中轉(zhuǎn)座元件所占的比例和其它已測(cè)序真核生物相比，僅低于玉米、大麥、人和小鼠等，遠(yuǎn)高于昆蟲中的果蠅和按蚊，占整個(gè)家蠶基因組的比例約40％[2]。家蠶基因組中的轉(zhuǎn)座元件主要由sho

4、rt interspersed nuclear elements(SINEs)和Non-long interspersed nuclearelements(non-LTRs)組成[3]。另外，家蠶中miniature inverted-repeat transposable elements(MITEs)轉(zhuǎn)座元件可以分為17個(gè)家族[2]。其中，Bombyx mori miniature inverted-repeattransposab

5、le element-2(BmMITE-2)家族在基因組中具有拷貝數(shù)多，同源性高和最近可能發(fā)生過爆發(fā)式擴(kuò)張等特征。因此，本文使用生物信息學(xué)、群體遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的方法，對(duì)家蠶BmMITE-2家族及其插入位點(diǎn)附近區(qū)域進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、BmMITE-2家族在家蠶中的插入缺失多態(tài)性分析以家蠶轉(zhuǎn)座元件BmMITE-2序列作為問詢序列，在NCBI和SilkDB[4]的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn同源性搜

6、索，發(fā)現(xiàn)BmMITE-2插入在ecdysteroid-regulated16kDa protein precursor(5.16 kDa)、Capa-a protein(Capa-a)、methyltransferase、ubiquinone biosynthesis proteinCOQ7-like protein(COQ7-L)、glucose-6-pheshate isomerase(1g6p)五個(gè)基因中。除COQ7-L的插入位點(diǎn)

7、是在5'UTR區(qū)域外，其余四個(gè)基因的插入位點(diǎn)都在3'UTR區(qū)域。根據(jù)這5個(gè)插入位點(diǎn)在基因組上的位置信息，在其兩端設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)來普查這5個(gè)插入位點(diǎn)在4個(gè)家蠶地理系統(tǒng)中的插入缺失多態(tài)性。并在此基礎(chǔ)上分析了宿主種群的遺傳關(guān)系。結(jié)果表明，在基因COQ7-L的5'UTR區(qū)域，所選用的116個(gè)家蠶品系中，BmMITE-2插入的品系有11個(gè)，僅占9.48％，并且都集中在中系和熱帶系統(tǒng)。剩余四個(gè)基因BmMITE-2插入品系基因型所占頻率所占

8、比例依次是：68.6％、71.95％、60.33％、55.32％。然后又選取16個(gè)野桑蠶品系進(jìn)行插入缺失多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)這些野桑蠶品系中，基因COQ7-L中沒有發(fā)現(xiàn)插入，而其它的四個(gè)基因中都發(fā)現(xiàn)有插入。
　　 根據(jù)BmMITE-2家族的5個(gè)插入位點(diǎn)的種群多態(tài)性分析，我們可以得到除BmMITE-2在基因1g6p和COQ7-L外，BmMITE-2在其它插入位點(diǎn)的基因型分布基本都符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)；各

9、種群的遺傳分化主要集中在種群內(nèi)部，且在不同的插入位點(diǎn)分化程度也不一樣；同時(shí)，對(duì)家蠶4個(gè)地理系統(tǒng)間的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)生分析暗示家蠶四大系統(tǒng)間并無(wú)明顯界限。
　　 2、BmMITE-2誘導(dǎo)的適應(yīng)性插入對(duì)COQ7-L基因5'UTR區(qū)域中的BmMITE-2在不同家蠶和野桑蠶品系中插入缺失情況進(jìn)行深入的研究。我們選取了10個(gè)插入品系，13個(gè)缺失品系。然后，對(duì)這23個(gè)家蠶品系中插入位點(diǎn)和距離插入位點(diǎn)前后2kb、5kb區(qū)域的側(cè)翼序列進(jìn)行克隆測(cè)

10、序，發(fā)現(xiàn)BmMITE-2的插入品系序列多態(tài)性顯著低于缺失品系。系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，插入品系和缺失品系分別聚類在一起。我們猜測(cè)這個(gè)結(jié)果可能是由BmMITE-2的插入而引起的；也有可能是由于這些插入是最近發(fā)生的，所以在該位點(diǎn)具有BmMITE-2插入的品系在親緣關(guān)系上較近。為了解決這個(gè)問題，我們選取了部分品系對(duì)其線粒體CR區(qū)域序列進(jìn)行發(fā)生分析，排除了第二種可能。
　　 通過RT-PCR的方法，檢測(cè)插入和缺失品系中基因COQ7-L的時(shí)期和

11、組織表達(dá)情況，結(jié)果表明插入和缺失品系中，該基因在時(shí)期表達(dá)沒有明顯的差別；但是在組織表達(dá)上，該基因的插入和缺失品系中有較大的差異，其中在缺失品系中的卵巢、絲腺、脂肪體、中腸和氣管中沒有表達(dá)，而在插入品系中均有表達(dá)。
　　 本文首次在家蠶中應(yīng)用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)的方法研究轉(zhuǎn)座元件的群體多態(tài)性及適應(yīng)性插入，另外，我們強(qiáng)調(diào)的是轉(zhuǎn)座元件對(duì)基因調(diào)控的作用。這不但對(duì)我們理解物種的多態(tài)性有很大的幫助，而且對(duì)理解轉(zhuǎn)座子的作用即增加基因的調(diào)控網(wǎng)