L1插入序列對GFP報告基因表達的影響.pdf

1、目的 基因組測序發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物的基因組中，單拷貝基因內(nèi)和基因之間散布著大量的轉(zhuǎn)座子，這些轉(zhuǎn)座子曾經(jīng)被認為是無用的“垃圾序列”。這些轉(zhuǎn)座子中最有代表性的就是LINE-1(long interspersed nuclear elements 1，長散布重復(fù)序列1，簡稱L1)。L1是人類基因組中含量最多的自主性逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，約占人類基因組DNA的17％。哺乳動物基因組中約1/3的成分都直接或間接跟L1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座有關(guān)。L1有2個開放讀

2、碼框(opened reading flame)，編碼2種蛋白質(zhì)：ORF1——編碼的蛋白有RNA結(jié)合活性，ORF2——編碼的蛋白有核酸內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶兩種活性，2種蛋白都是L1轉(zhuǎn)座所必需的。迄今為止已發(fā)現(xiàn)L1與多種生物學(xué)現(xiàn)象關(guān)聯(lián)，包括基因突變， X染色體失活，基因重排，基因表達沉默，腫瘤發(fā)生，生物進化等。在機體免疫系統(tǒng)中，T細胞和B細胞抗原受體等位基因排斥，IL-2、IL-4的基因表達都與L1有關(guān)。 最近，已有研究表明：L1序列

3、能夠下調(diào)基因的表達——Hart將L1.2的ORF2(L1重復(fù)序列的一部分)和LacZ分別插入到GFP報告基因下游。與插入LacZ的序列比較，ORF2顯著減少GFP蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，使GFP的RNA生成量減少70倍。當(dāng)改變下游插入片段ORF2的讀碼框時，GFP的表達仍然受到相同的抑制作用。Han同時還觀察到，插入反義ORF2也抑制GFP RNA和GFP蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，但是作用較弱。 已知L1有10個家族，根據(jù)其ORF2和3'非翻譯區(qū)同源

4、性進行分類，這10個家族又可以分為75種亞家族，各個亞家族之間存在序列上的差異。因此，上述L1序列下調(diào)基因表達的結(jié)果是否對其它L1亞家族也是如此，尚未得知。更兼最近還有文獻報道，在GFP-L1轉(zhuǎn)基因小鼠中，GFP報告基因可以在小鼠睪丸中表達，但是在其它組織不表達，很明顯L1成分參與調(diào)控基因表達在不同的細胞中也不相同。因此，有必要研究L1序列參與調(diào)控基因表達的不同影響因素。 為此，本文擬用L1PA3(L1序列的一個亞家族)序列上的

5、ORF2為研究對象，從ORF2調(diào)節(jié)基因表達的角度出發(fā)，揭示L1序列調(diào)控基因表達的影響因素，為進一步探討L1下調(diào)基因表達的潛在機制，提供實驗依據(jù)。 方法 1 按照引物設(shè)計原則，設(shè)計目的序列的引物，采用PCR技術(shù)，擴增目的序列作為插入片段。在引物中加入合適的酶切位點，根據(jù)實驗需要采用雙酶切或單酶切。 2 選擇pEGFP-C1作為載體，先將載體和插入片段用相同的限制性內(nèi)切酶酶切，然后用T4 DNA連接酶連接。轉(zhuǎn)化DH5

6、α菌株，PCR法篩選陽性克隆，進一步用酶切和測序鑒定。 3 用Lipofectamine<'TM>2000將重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞。熒光顯微鏡下計數(shù)GFP熒光陽性細胞數(shù)，在白光下計數(shù)同樣視野的細胞總數(shù)(每個樣本至少500個)，計算熒光陽性細胞百分率。在白光和熒光下分別對同一視野照相。 結(jié)果 1 重組質(zhì)粒鑒定將PCR擴增的ORF2正、反序列插入pEGFP-C1質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶(Xho Ⅰ和PstⅠ)消化鑒

7、定和測序分析，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒P-ORF2，P-ORF2as。 將PCR擴增的LacZ正、反序列插入pEGFP-C1質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶(Xho Ⅰ和Pst Ⅰ)消化鑒定和測序分析，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒p-LacZ，P-LacZas。 將PCR擴增的ORF2/A(Apa Ⅰ酶切)和ORF2/Am(ApaⅠ酶切，讀碼框改變)的反序插入pEGFP-C1質(zhì)粒，經(jīng)過測序分析，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒p-ORF2as/A，p-ORF2a

8、s/Am。 將PCR擴增的SV40 polyA反序插入p-ORF2as/Am質(zhì)粒ORF2as/Am片段上游的Pst Ⅰ酶切位點，經(jīng)過測序分析，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒p-Aas-ORF2as/Am。 2 插入ORF2和LacZ正、反序?qū)FP基因表達的影響在pEGFP-C1質(zhì)粒GFP基因下游按正、反方向插入ORF2和LacZ，共有p-ORF2，p-ORF2as，p-LacZ，p-LacZas四種重組質(zhì)粒，用pEGFP-C1作為

9、對照，轉(zhuǎn)染HeLa細胞，熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染細胞的熒光細胞陽性率為： p-ORF2(0.53±0.10)％ p-ORF2as(2.28±0.66)％ p-LacZ(1.82±0.3 1)％ p-LacZas(1.07±0.33)％ pEGFP-C1(23.88±0.93)％ 3 插入ORF2as/A，ORF2as/Am及polyAas-ORF2as/Am對GFP基因表達的影響以O(shè)RF2as為主要研究對象，先將改變酶切位點的ORF

10、2as/A片段插入pEGFP-C1質(zhì)粒GFP基因下游，構(gòu)建p-ORF2as/A。再改變ORF2as/A片段的讀碼框，構(gòu)建p-ORF2as/Am。最后在ORF2as/Am上游插一段polyAas，構(gòu)建p-Aas-ORF2as/Am。連同p-ORF2as、pEGFP-C1共5種質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細胞，熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染細胞的熒光細胞陽性率為： p-ORF2as(2.5±0.92)％ P-ORF2as/A(10.6±0.65)％ p-ORF

11、2as/Am(0.39±0.10)％ p-Aas-ORF2as/Am(12.53±0.87)％ pEGFP-C1(24.13±1.43)％ 4 熒光表達分析 (1)p-ORF2(0.53±0.10)％，p-ORF2as(2.28±0.66)％，p-LacZ(1.82±0.31)％和p-LacZas(1.07±0.33)％的熒光細胞陽性率明顯低于對照pEGFP-C1(23.88±0.93)％的熒光細胞陽性率(P<0.01)

12、。 (2)轉(zhuǎn)染p-ORF2(0.53±0.10)％的熒光細胞陽性率明顯低于p-ORF2as(2.28±0.66)％，p-LacZ(1.82±0.3 1)％和p-LacZas(1.07±0.33)％的熒光細胞陽性率(P<0.05)。 (3)轉(zhuǎn)染p-ORF2as/A(10.6±0.65)％的HeLa細胞熒光陽性率高于p-ORF2as(2.5±0.92)％的熒光陽性率(P<0.01)。 (4)轉(zhuǎn)染p-ORF2as/Am

13、(0.39±0.10)％的HeLa細胞熒光陽性率明顯低于p-ORF2as/A(10.6±0.65)％的熒光陽性率(P<0.01)。 (5)轉(zhuǎn)染p-Aas-ORF2as/Am(12.53±0.87)％的HeLa細胞熒光陽性率明顯高于p-ORF2as/Am(0.39±0.10)％的熒光陽性率(P<0.01)。 結(jié)論 1 在pEGFP-C1質(zhì)粒的GFP基因下游插入片段大小相同，但序列不同的DNA片段時，均能抑制上游GF