利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)建紫花苜蓿耐鹽新種質(zhì)的研究.pdf

1、作物生長(zhǎng)、產(chǎn)量和質(zhì)量受土壤鹽漬化限制,已成為世界上的一個(gè)普遍問題。紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)是一種優(yōu)良的豆科牧草,蛋白質(zhì)含量高,維生素和礦物質(zhì)含量豐富,氨基酸種類齊全,且適口性好,在我國(guó)北方地區(qū)的農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)建設(shè)中發(fā)揮極其重要的作用。然而,多數(shù)紫花苜蓿品種耐鹽能力差,不合適在鹽堿地種植。因此,培育合適在鹽堿地種植的耐鹽豐產(chǎn)的紫花苜蓿新品種,充分利用鹽堿地,提高牧草產(chǎn)量,是發(fā)展農(nóng)牧業(yè)經(jīng)濟(jì)和改善生態(tài)環(huán)境的有效途徑。

2、現(xiàn)代生物技術(shù)育種的迅速發(fā)展,為培育新的品種提供了高效快捷的方法。
　　 本研究選擇紫花苜蓿阿爾岡金品種為材料,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了耐鹽性遺傳改良,獲得了耐鹽性提高的新種質(zhì)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、對(duì)紫花苜蓿阿爾岡金品種種子發(fā)芽期和苗期的耐鹽性分析,結(jié)果表明225mmol／L和300 mmol／L的NaCl濃度分別是發(fā)芽期和苗期耐鹽性篩選的適合濃度。
　　 2、利用花粉管通道法將鹽生植物紅樹(Rhizop

3、hora apiculata L.)總DNA導(dǎo)入紫花苜蓿,獲得12株耐鹽性強(qiáng)的植株。以供體和受體為對(duì)照,對(duì)12株耐鹽植株進(jìn)行RAPD分析,條帶的差異性表現(xiàn)為新增條帶、供體特異條帶和受體條帶丟失。分析引物S178和引物S198在植株Ms-ra3中出現(xiàn)的供體特異條帶和新增條帶序列,初步證實(shí)外源DNA已經(jīng)整合到受體的基因組中,而且T0代植株耐鹽能力提高可能與外源基因的導(dǎo)入有關(guān)。移栽T0代耐鹽植株至實(shí)驗(yàn)地,人工輔助同株自交授粉,獲得T1代種子。

4、225 mmol／L NaCl篩選獲得T1代幼苗,T1代幼苗經(jīng)300 mmol／L NaCl脅迫后測(cè)定耐鹽相關(guān)生理生化指標(biāo),結(jié)果表明T1代植株耐鹽性明顯增強(qiáng)。T2代幼苗經(jīng)0.6％NaCl脅迫處理21 d,獲得了T2代耐鹽株系。
　　 3、比較分析了培養(yǎng)基成分(MS培養(yǎng)基、UM培養(yǎng)基、SH培養(yǎng)基)和激素配比對(duì)阿爾岡金品種下胚軸、子葉和子葉節(jié)再生的影響,發(fā)現(xiàn)子葉節(jié)在添加3.0mg／L6-BA的SH培養(yǎng)基上適宜遺傳轉(zhuǎn)化,生根培養(yǎng)時(shí)添加

5、0.5mg／L IBA。在此基礎(chǔ)上,本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次將鹽生植物鹽角草(Salicornia europaeaL.)Na+／H+逆向運(yùn)輸?shù)鞍谆騍eNHX1導(dǎo)入阿爾岡金,PCR檢測(cè)獲得36株T0代轉(zhuǎn)基因植株,移栽溫室培養(yǎng)獲得6株生長(zhǎng)旺盛的植株。RT-PCR檢測(cè)顯示SeNHX1基因在5個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中獲得了表達(dá)。0.6％NaCl脅迫表達(dá)外源基因的5個(gè)轉(zhuǎn)基因植株扦插苗后測(cè)定耐鹽相關(guān)生理生化指標(biāo),結(jié)果表明這5個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的多數(shù)耐鹽相關(guān)生

6、理生化指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照,而且有1個(gè)轉(zhuǎn)基因植株(MseNHX75)所測(cè)定耐鹽相關(guān)生理生化指標(biāo)均優(yōu)于其他轉(zhuǎn)基因植株。加代培養(yǎng)獲得T1代植株,經(jīng)PCR鑒定篩選獲得了T1代轉(zhuǎn)基因株系。
　　 4、首次克隆了紫花苜蓿阿爾岡金鹽誘導(dǎo)表達(dá)基因MsPRP2啟動(dòng)子序列,大小為1521 bp,與GenBank中報(bào)道的序列(AF028841)的同源性為93.7％,且含有2個(gè)大的AT富含區(qū)和1個(gè)G-box。成功構(gòu)建了鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SeNHX1基因的植