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文檔簡介
1、近年來,應(yīng)用基因工程手段改造自然界中現(xiàn)有根瘤菌的某些遺傳性狀,如結(jié)瘤競爭力、固氮酶活性、吸氫酶活性、耐氨、耐鹽性等,已經(jīng)成為生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的一個重要研究方向。而構(gòu)建高效耐鹽的根瘤菌工程菌株,提高根瘤菌耐鹽水平,為生物肥料的研制奠定基礎(chǔ)則具有重要的應(yīng)用價值。 本研究以啤酒酵母為材料,利用PCR技術(shù)分離得到耐鹽基因HAL1,其編碼框全長885bp,編碼294個氨基酸。將HAL1插入到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的EcoRI和
2、XhoI位點(diǎn)中間,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,經(jīng)三親雜交導(dǎo)入苜蓿根瘤菌得到耐鹽工程菌株。用此工程菌接種紫花苜蓿,研究了接種后對紫花苜蓿生長的影響。 主要取得以下研究結(jié)果: 1.工程菌中的重組質(zhì)粒在自生培養(yǎng)條件下傳代的穩(wěn)定性:將純化的工程菌在YMA培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接5次后檢測其丟失率,結(jié)果表明在無抗性選擇的情況下,連續(xù)轉(zhuǎn)接重組質(zhì)?;緵]丟失,證明重組質(zhì)粒pGEX-HAL1在苜蓿根瘤菌中能夠穩(wěn)定存在和遺傳。 2.工程菌中融合蛋白:提
3、取工程菌中的融合蛋白并進(jìn)行純化,結(jié)果表明當(dāng)誘導(dǎo)時間為3h,IPTG濃度是1 mmol/L 時,融合蛋白產(chǎn)量最多。1ml培養(yǎng)物中產(chǎn)生的融合蛋白大約有3mg,純化蛋白占可溶總蛋白的1.56%。 3.工程菌在不同鹽濃度培養(yǎng)基中的生長情況:把苜蓿根瘤空白菌和攜帶 HAL1的工程菌分別接在含3%、5%、7%和9%NaCl的YMA培養(yǎng)基中,結(jié)果表明,在相同鹽濃度的培養(yǎng)基中,工程菌的OD<,600>值都大于對照,說明工程菌的生長狀態(tài)好于空白菌
4、。 4.將苜蓿種在不同鹽濃度的培養(yǎng)基中,然后用根瘤工程菌和根瘤空白菌接種,結(jié)果表明,工程菌接種后的植株在不同鹽濃度培養(yǎng)基上的生長狀況均比對照好。30d后空白菌接種的對照植株已經(jīng)枯萎死亡,但工程菌接種的植株還明顯帶有綠色,由此可見工程菌接種后可提高苜蓿的耐鹽水平。 5.工程菌的促生作用:把苜蓿種在滅菌沙土中,定期澆無氮營養(yǎng)液,待苜蓿長出第一片真葉時,分別接種工程菌和根瘤空白菌,40d后觀察苜蓿的生長情況。結(jié)果表明用工程菌接
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