副豬嗜血桿菌hhdA基因缺失株的構(gòu)建及胞外絲氨酸蛋白酶免疫原性的研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是豬上呼吸道的常在菌。其致病菌在一定條件下可引起以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征的革拉澤氏病(Glasser's Disease)。近年來，該病在保育豬群中的發(fā)生逐年上升，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，受到人們的日益重視。雖然近幾年加大了該病原的研究力度，篩選出大量的毒力相關(guān)基因，但目前為止尚不十分清楚HPS的致病機(jī)理。
　　 本研究利用重疊PCR(ov

2、erlapping PCR)的方法構(gòu)建了HPS hhdA基因的外源打靶基因Hup-Kan-Hdown。將其連接至自殺性質(zhì)粒載體pDS132，獲得了可在宿主菌E.coli SM10λpir中穩(wěn)定遺傳的外源打靶載體pDS-HPhhdA-Kan。將該打靶載體用電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入HPS中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選和蔗糖負(fù)篩選，得到HPS hhdA基因缺失株(HPSAhhdA)。生化試驗(yàn)表明，該突變株的生化特性及NAD生長依賴性未見改變。生長曲線的測定表明該突

3、變株的生長慢于標(biāo)準(zhǔn)株。豚鼠感染試驗(yàn)表明毒力變化不明顯。說明hhdA基因不影響HPS的生長、繁殖，與其致病力無明顯相關(guān)性。本試驗(yàn)建立的HPS遺傳操作突變系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)室日后驗(yàn)證HPS各種基因功能奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究對HPS的一種胞外絲氨酸蛋白酶(extracellular serine protease，esp)進(jìn)行了序列分析并將該蛋白進(jìn)行原核表達(dá)。HPS esp一級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，前23個(gè)氨基可能為信號(hào)肽序列。C端轉(zhuǎn)運(yùn)單位氨基酸序

4、列的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，該蛋白與流感嗜血桿菌中IgA蛋白酶的親緣關(guān)系較近。承載結(jié)構(gòu)域抗原表位的分析表明，50～57、95～108、120～130、185～196、230～241和421～425等6個(gè)氨基酸序列表位抗原的可能性較大。將克隆的esp基因連接至表達(dá)載體pET30a，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET-esp。將測序鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)大量誘導(dǎo)條件優(yōu)化試驗(yàn)，得到了IPTG終濃度為0.6 mmol/L，32℃振蕩培養(yǎng)6