矮牽牛PMADS3及其互作候選基因功能初步分析.pdf

1、矮牽牛(Petuniahybrida)為茄科（Solanaceae）矮牽牛屬（PetuniaJuss.）草本花卉，被廣泛應(yīng)用于園林中，同時(shí)它也是研究植物花發(fā)育遺傳機(jī)理的重要模式植物之一。自上世紀(jì)九十年代以來(lái)，人們就對(duì)矮牽?；ㄆ鞴侔l(fā)育機(jī)制展開了深入研究，并提出了花發(fā)育的ABCDE模型。其中，PMADS3是從矮牽牛中克隆出來(lái)的C功能基因，其組織原位表達(dá)固定在第三、四輪花器官上，同時(shí)具有花分生組織和花器官?zèng)Q定的功能，超量表達(dá)PMADS3基因會(huì)

2、使野生型矮牽牛的花瓣上出現(xiàn)花藥結(jié)構(gòu)以及花萼心皮化，而PMADS3基因被抑制則雄蕊出現(xiàn)明顯的瓣化。由此可見(jiàn)，PMADS3基因與第二、三輪花器官同源異型轉(zhuǎn)換存在極大的關(guān)系，即與重瓣基因存在關(guān)系。因此，對(duì)矮牽牛PMADS3及其互作基因展開研究不僅對(duì)重瓣育種具有極其重要的意義，而且雄蕊瓣化性狀還可以應(yīng)用于創(chuàng)造不育系。
　　為了進(jìn)一步探索PMADS3在矮牽牛中調(diào)控花器官發(fā)育的具體途徑，發(fā)掘出與其相互作用的相關(guān)調(diào)控因子，本實(shí)驗(yàn)將PMADS3全

3、長(zhǎng)的干涉載體轉(zhuǎn)化矮牽牛，觀測(cè)表型并進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析在轉(zhuǎn)基因植株中其他相關(guān)花發(fā)育基因的表達(dá)情況;同時(shí)從前期實(shí)驗(yàn)室篩選出的與PMADS3互作的基因中挑選5個(gè)，并采用Gateway技術(shù)構(gòu)建了RNAi載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化矮牽牛，獲得轉(zhuǎn)基因植株并分析表型。實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1、PMADS3基因全長(zhǎng)干涉載體轉(zhuǎn)化矮牽牛分析表型。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將PMADS3干涉載體轉(zhuǎn)化矮牽牛并利用PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。

4、在獲得的陽(yáng)性植株中，有67％的植株表現(xiàn)出雄蕊不同程度的瓣化，同時(shí)子房增大，但空癟、內(nèi)陷明顯，花柱短小，柱頭頂端閉合，后期全部無(wú)法結(jié)實(shí)。
　　2、轉(zhuǎn)基因矮牽牛中其他相關(guān)基因的實(shí)時(shí)定量PCR分析。以GAPDH為內(nèi)參基因，前期課題組篩選出的與單重瓣相關(guān)的表達(dá)基因?yàn)槟康幕?，?shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)干涉載體Phellsgate2-PMADS3的強(qiáng)表型植株和未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株之間，表達(dá)量差異顯著的轉(zhuǎn)錄因子主要

5、有FBP6，F(xiàn)BP7，PMADS3，PMADS4，PMADS9，PMADS15。其中，在轉(zhuǎn)基因植株中下調(diào)表達(dá)的基因有FBP6，F(xiàn)BP7，PMADS3，PMADS4，PMADS9，上調(diào)表達(dá)的基因?yàn)镻MADS15。目標(biāo)基因PMADS3在轉(zhuǎn)化植株中相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.09，表現(xiàn)為極顯著的下調(diào)表達(dá)。
　　3、利用Gateway技術(shù)構(gòu)建矮牽牛中與PMADS3互作的5個(gè)基因的RNAi載體。提取矮牽牛RNA，RT-PCR獲得其cDNA，然后PCR

6、擴(kuò)增含有attB接頭的目的基因，將attB-PCR產(chǎn)物與Phellsgate2表達(dá)載體在BP酶作用下進(jìn)行重組反應(yīng)獲得RNAi載體Phellsgate2-AD23、Phellsgate2-AD30、Phellsgate2-AD35、Phellsgate2-AD63和Phellsgate2-AD66。
　　4、矮牽牛PMADS3的互作候選基因轉(zhuǎn)化矮牽牛。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將AD23、AD30、AD35、AD63、AD66共5個(gè)互作基

7、因的干涉載體轉(zhuǎn)化矮牽牛并利用PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，最終分別獲得陽(yáng)性植株25株、20株、23株、23株和27株。在獲得的AD63轉(zhuǎn)基因植株部分株系中，T0代在營(yíng)養(yǎng)期葉片皺縮反卷，葉片變厚，整株呈蓮座狀，頂端分生組織消失;花期雄蕊弱瓣化，子房增大，略顯皺縮，不飽滿，后期仍然能夠正常結(jié)實(shí)，但T0代種子活性降低。T1代植株開花期雄蕊瓣化現(xiàn)象得到了明顯的加強(qiáng)，表現(xiàn)為雄蕊瓣化的強(qiáng)表型，花藥頂端衍生出明顯的花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)。其它四個(gè)基因轉(zhuǎn)化的矮牽牛未得