矮牽牛PMADS9，PMADS1和CHSJ基因片段克隆及hpRNAi載體構(gòu)建.pdf

1、RNA干擾(RNAi)是一種新發(fā)現(xiàn)的通過dsRNA介導(dǎo)的特異同源靶基因抑制途徑。因RNAi基因沉默具有高效、特異和簡捷等優(yōu)點(diǎn)，為細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)研究提供了新思路、新方法，從而使其具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來RNAi引起的PTGS逐步被用于基因功能的研究，并且在植物的抗病毒及品質(zhì)遺傳改良中的應(yīng)用也得到了長足的發(fā)展。 以往對植物基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后沉默的手段有反義識別和共抑制兩種。但是，通過這兩種手段僅能得到有限數(shù)目的沉默個(gè)體植株。2001年

2、，S.Varsha Wesley等人通過對一種能過自我滿足配對的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA(hpRNA)的研究證實(shí)了此種結(jié)構(gòu)可有效提高基因沉默效率。利用這種在正義臂及反義臂結(jié)構(gòu)之間存在一個(gè)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的載體可更加有效的提高基因沉默的效率。從而比反義識別及共抑制在對基因功能的研究上更加有效。 MADS-box基因是指含有保守的DNA結(jié)合域MADS盒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它們廣泛存在于真核生物界。是一類重要調(diào)節(jié)基因，在植物發(fā)育(尤其是花器官發(fā)育以及

3、同源異型轉(zhuǎn)換中)過程中扮演者十分重要的角色。分離并研究MADS-box基因，將有助于探明植物生殖發(fā)育的分子模式，并為觀賞植物和花卉品種的基因工程改良奠定基礎(chǔ)。 PMADS9是最近在觀賞花卉矮牽牛中發(fā)現(xiàn)的AGL15亞家族基因，其功能尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過PCR技術(shù)從矮牽牛幼蕾cDNA中克隆出PMADS9，PMADS1和CHSJ基因，分別構(gòu)建了hpRNAi植物表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將三個(gè)基因?qū)氚珷颗?。主要?shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

4、 1.矮牽牛PMADS9基因片段的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建 以矮牽牛(Petunia hybrida)基因組DNA為模板，通過設(shè)計(jì)兩對分別添加不同酶切位點(diǎn)的特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得PMADS9基因片段。PMADS9基因片段序列與已公布序列(GenBank登錄號：AY370526)中相應(yīng)片段完全一致，構(gòu)建了hpRNi植物表達(dá)載體pDH-1。 2.矮牽牛PMADS1基因片段的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建 以矮牽牛(Pe

5、tunia hybrida)幼蕾cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)兩對分別添加不同酶切位點(diǎn)的特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得PMADS1基因片段。序列分析表明，PMADS1基因片段序列與已公布序列(GenBank登錄號：X14599)比對，所擴(kuò)增片段與之完全一致。構(gòu)建了hpRNAi植物表達(dá)載體pDH-2。 3.矮牽牛CHSJ基<片段的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建 以矮牽牛(Petunia hybrida)幼蕾cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)兩對分別