豬下丘腦——垂體——甲狀腺軸五個關(guān)鍵基因的研究.pdf

1、候選基因鑒定法是分析數(shù)量性狀基因的重要方法。本論文以在機體物質(zhì)與能量代謝、個體生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用的下丘腦-垂體-甲狀腺軸五個關(guān)鍵調(diào)控基因：促甲狀腺激素釋放激素前體TRH基因、促甲狀腺激素釋放激素受體TRHR基因、組成促甲狀腺激素的糖蛋白激素共同亞基CGA基因和促甲狀腺激素β亞基TSHB基因，以及促甲狀腺激素受體TSHR基因為研究對象，應(yīng)用生物信息學(xué)、輻射雜交細胞系定位技術(shù)、3'RACE、實時熒光定量RT-PCR、PCR-RFLP

2、、四引物ARMS-PCR等技術(shù)對HPT軸五個關(guān)鍵基因進行染色體定位、QTL分布分析、cDNA克隆、組織表達譜分析、遺傳多態(tài)尋找以及與豬主要經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)分析研究，以期了解HPT軸該五個關(guān)鍵基因的分子生物學(xué)特性，并為豬主要經(jīng)濟性狀遺傳改良和標記輔助選擇提供科學(xué)依據(jù)。實驗主要得出以下一些結(jié)果：
　　 (1)應(yīng)用生物信息學(xué)和輻射雜交細胞系定位技術(shù)，HPT軸五個關(guān)鍵基因分別被定位于豬13、4、1、4和7號染色體。根據(jù)QTL數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果

3、，五個基因全部位于日增重、肌肉品質(zhì)和脂肪性狀相關(guān)QTL內(nèi)，提示豬HPT軸基因多態(tài)與個體生長速度、肉質(zhì)和脂肪性狀差異可能存在重要關(guān)聯(lián)，為相應(yīng)QTL的位置功能候選基因。
　　 (2)本論文首次克隆獲得豬TRHR基因mRNA序列，并在分子水平上進行了深入分析。豬TRHR基因與人TRHR基因進化上很接近。除TRHR基因的功能性轉(zhuǎn)錄本外，本論文實驗中還發(fā)現(xiàn)了另外兩種轉(zhuǎn)錄本類型。其中，轉(zhuǎn)錄本2為功能轉(zhuǎn)錄本1的截斷型，僅含N端結(jié)構(gòu)、跨膜螺旋1

4、-5及部分胞內(nèi)環(huán)3序列，缺失跨膜域6和7以及蛋白c端結(jié)構(gòu)；而轉(zhuǎn)錄本3則恰與轉(zhuǎn)錄本2相反，剪切661 bp的選擇性剪接內(nèi)含子后，使之缺失了TRHR蛋白的N端編碼序列，但保留有C端編碼序列。然而選擇性內(nèi)含子的剪接，破壞了原閱讀框，轉(zhuǎn)錄本3可能編碼一種新的功能蛋白，也可能使用了不同的翻譯起始位點。多種轉(zhuǎn)錄本存在的意義有待研究。
　　 (3)采用熒光定量RT-PCR技術(shù)，檢測了HPT軸五個關(guān)鍵基因在大腦、下丘腦、垂體、心、肝、脾、肺、腎

5、、甲狀腺、胰、胃、小腸、大腸，以及肌肉和皮下脂肪共15個組織中的表達分布。HPT軸激素及其受體在外周組織，如皮下脂肪中的共表達，提示相應(yīng)激素可能通過旁分泌或自分泌方式對局部組織進行著生長發(fā)育調(diào)控。
　　 (4)以金華豬和皮特蘭資源家系親本個體為模板，共設(shè)計17對引物擴增HPT軸五個關(guān)鍵基因總長11，340 bp的DNA序列，進行PCR再測序以尋找核苷酸多態(tài)變異。分析基因測序峰圖，共發(fā)現(xiàn)37個多態(tài)座位，其中位于TRH基因多態(tài)座位8

6、個，TRHR基因多態(tài)座位7個，CGA基因多態(tài)座位14個，TSHB基因多態(tài)座位5個，TSHR基因多態(tài)座位3個。檢測到的所有多態(tài)座位都提交到了國際SNP數(shù)據(jù)庫dbSNP，并獲得SNP登錄號。根據(jù)多態(tài)座位彼此間距離間隔、側(cè)翼序列特點及其潛在功能重要性，選擇了其中20個座位，采用PCR-RFLP和四引物ARMS-PCR技術(shù)設(shè)計并優(yōu)化了分型方法。
　　 (5)對49頭純種金華豬和24頭純種皮特蘭豬進行HPT軸20個多態(tài)座位的分型，并采用H

7、apBlock軟件進行基因單倍型塊分析和標簽SNP選擇。除TRH基因SNP在金華豬中分布于兩個單倍型塊外，其他基因的SNP座位均位于同一單倍型塊中。結(jié)合兩個品種的單倍型區(qū)塊和標簽SNP集合信息，共選擇了3個TRH基因標簽SNP，3個TRHR基因標簽SNP，5個CGA基因標簽SNP，3個TSHB基因標簽SNP和1個TSHR基因標簽SNP，用于在金華豬與皮特蘭資源家系中進行HPT軸基因多態(tài)遺傳效應(yīng)分析。
　　 (6)在金華豬與皮特蘭

8、資源家系共463頭個體中分析了HPT軸基因多態(tài)性與豬生長、胴體和肉質(zhì)共30個主要經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)性，并在在約克夏、杜洛克、長白豬以及嘉興黑豬中進行了一定的驗證分析。分析結(jié)果顯示：
　　 1)在金皮資源家系中TRH ss325994933與個體生長發(fā)育后期，尤其是150-180日齡期間增重有顯著關(guān)聯(lián)，其在國內(nèi)和國外豬種中的基因頻率亦存在明顯的對立分布差異，但在生長較慢的金華豬中占優(yōu)勢的插入突變卻在資源家系中表現(xiàn)為生長優(yōu)勢。本研究認為

9、TRH基因可能在中外豬種生長性狀差異形成中有一定影響，是相關(guān)日增重QTL下的位置功能候選基因，但其多態(tài)座位效應(yīng)仍有待進一步挖掘驗證。
　　 2)TRHR基因多態(tài)性的種群間分化較大。在金皮資源家系中，其對個體頭重和胴體長有極顯著效應(yīng)，對眼肌的導(dǎo)電率、pH值、系水力、肌內(nèi)水份和肌內(nèi)脂肪性狀有顯著影響。TRHR基因與多項肉質(zhì)指標存在顯著關(guān)聯(lián)，且在肌肉組織中有表達，本文認為有必要對TRHR基因在豬肌肉組織中的功能進行深入研究。
　

10、　 3)盡管本文發(fā)現(xiàn)CGA基因多態(tài)性與豬肌內(nèi)水份含量存在顯著關(guān)聯(lián)，此前并未見肌內(nèi)水份QTL，定位于CGA基因?？赡苡捎贑GA基因內(nèi)微衛(wèi)星的存在，造成較頻繁的基因內(nèi)重組，而使基因效應(yīng)表現(xiàn)不穩(wěn)定。所有5個CGA SNP在國內(nèi)外豬種中均未表現(xiàn)出明顯對立的等位基因頻率分布差異。因此本研究認為，CGA基因多態(tài)性可能在國內(nèi)外豬種性狀差異形成中不具有重要地位。
　　 4)TSHB基因的種群間分化也較大。在金皮資源家系中，TSHB基因多態(tài)性對

11、豬90-120日齡期間增重、后腿肌肉重有統(tǒng)計顯著效應(yīng)，對豬胴體重、胴體長和平均背膘厚有極顯著效應(yīng)。含金華豬單倍型G-G-A純合子個體較皮特蘭單倍型A-G-G純合子個體增重顯著慢，與一般認為的金華豬生長速度慢相一致。并且含皮特蘭單倍型A-G-G個體背膘厚顯著小于含金華豬單倍型G-G-A個體。此外，在杜洛克群體中，TSHB SNP座位ss181129015與背膘厚也存在顯著關(guān)聯(lián)，在國外豬種中占優(yōu)勢的等位基因A有降低背膘厚的效應(yīng)，驗證了在金皮

12、資源家系中的分析結(jié)果。因此本研究認為，TSHB基因，尤其是其SNP ss181129015具有作為遺傳分子標記應(yīng)用于豬背膘厚性狀改良育種中的價值。
　　 5)TSHR基因多態(tài)性座位的等位基因A在所有豬種中均以低頻出現(xiàn)。金皮資源家系中，TSHR基因多態(tài)性對個體生長發(fā)育后期120日齡至180日齡期間增重以及眼肌pH值有顯著影響。在長白豬群體中的關(guān)聯(lián)分析，進一步確證了TSHR與日增重的關(guān)聯(lián)性。然而，在金皮資源家系中表現(xiàn)出生長優(yōu)勢的等位