海洋微藻的分離及鑒定方法的初步研究.pdf

1、海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的最主要初級生產(chǎn)者,也是海洋生物資源的重要組成部分,具有種類多、數(shù)量大、繁殖快等特點(diǎn),在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中起著極其重要的作用。同時(shí),微藻本身營養(yǎng)豐富,富含人類必須的蛋白質(zhì),氨基酸、不飽和脂肪酸、多糖、類胡蘿卜素等生物活性物質(zhì),在基礎(chǔ)生物學(xué)研究、水產(chǎn)養(yǎng)殖、新能源的開發(fā)、藥物研制等領(lǐng)域具有重要開發(fā)價(jià)值。我國海洋微藻資源豐富,已記錄的近2000種。近年來,隨著陸地資源的衰竭,豐富的海洋微藻資源成了人們關(guān)

2、注的熱點(diǎn),從海洋中獲取更多高值的微藻品種成為一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)性工作。
　　 微藻的鑒定及分類是藻類研究的基礎(chǔ),也一直是較為困難的課題之一。傳統(tǒng)的微藻鑒定方法主要依賴于顯微鏡對微藻形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察和一些藻體所固有的生理生化特性。但是對于微微型的藻類,其可以識別并用于描述和物種鑒定的形態(tài)學(xué)特征非常少,與近緣種之間的差異非常不明顯。在普通光學(xué)顯微鏡下,很難確定其準(zhǔn)確的分類地位。
　　 分子生物學(xué)方法由于操作容易和結(jié)果直接可靠,被廣

3、泛的用于微藻的分類鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究中。通過選擇有代表性的序列片段作為分類標(biāo)準(zhǔn),來區(qū)分不同生物間,同種生物種內(nèi)株系之間的遺傳差異就成為當(dāng)前研究的主要方向,為微藻的鑒定工作提供了一個(gè)新的有效方法。
　　 通過涂平板的方法,從青島近海分離得到一株海洋微藻。通過普通光學(xué)顯微鏡觀察,同時(shí)結(jié)合掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡進(jìn)行制片觀察,并測定其18S rRNA基因(rDNA)序列來確定其準(zhǔn)確的分類地位。將獲得的18S rDNA與GenBa

4、nk上已經(jīng)登錄的序列進(jìn)行BLAST比對,結(jié)果顯示,其序列與微擬球藻屬的一個(gè)種:Nannochloropsis gaditana完全一致。進(jìn)化樹分析顯示,該藻株與所有的N.gaditana株系聚為一支,而與其他的種區(qū)別開來。因此,推測該藻株可能為微擬球藻屬的一個(gè)種:N.gaditana。
　　 Hibberd(1981)確定了微擬球藻屬的分類地位,目前命名的有7個(gè)種。該屬主要分布于海洋環(huán)境中,淡水和半咸水中比較少見。由于其能積累較

5、高水平的高不飽和脂肪酸而具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景,同時(shí)被廣泛的作為能量食物用于育苗中。該屬所有的種都很微小,長橢圓形,直徑約2微米,在形態(tài)學(xué)特征上幾乎沒有區(qū)別。這些藻超微結(jié)構(gòu)也非常簡單,通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡也難以區(qū)別。其分類主要通過18S rDNA和ITS序列分析。
　　 本研究利用18S rDNA和ITS序列分析了分離自不同地方的6株微擬球藻,并分析了它們之間的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示:所有的藻株的序列與NCBI登錄的N.oce

6、anica一致,而與其他的種類區(qū)別開來,認(rèn)為該六株藻為N.oceanica的不同株系。ITS分析顯示,編號為C146和編號為Cdl的親緣關(guān)系較近,在全部613個(gè)堿基中,兩者的堿基差異為零,為同一個(gè)序列。另外的四個(gè)株系的親緣關(guān)系較近,與第一組擁有10個(gè)相同的變異位點(diǎn)。某些株系擁有一到兩個(gè)個(gè)別差異位點(diǎn),證實(shí)了ITS變異位點(diǎn)的豐富性。位于兩個(gè)ITS區(qū)的5.8S區(qū)的總長度為160bp,在六個(gè)株系中沒有變化,顯示出其保守性。這六株微擬球藻中,兩兩

7、之間核苷酸差異大小為0％-2.4％。根據(jù)前人的研究成果,這六個(gè)株系可能為微擬球藻的同一種的不同株系。故18S rDNA和ITS分析的結(jié)果是溫和的。
　　 普通的光學(xué)顯微鏡,由于放大倍數(shù)和分辨率的限制,對于微擬球藻等微型,同時(shí)又不具有特征性的表面結(jié)構(gòu)的藻類,很難準(zhǔn)確鑒定。由于分子生物學(xué)分類方法是以核酸序列的差異為依據(jù),而核酸序列遺傳的穩(wěn)定性非常高,幾乎不受環(huán)境條件的影響,使得結(jié)果的準(zhǔn)確性非常高。18S rDNA和ITS序列分析,為