應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選兔出血癥病毒抗原模擬表位及其ELISA抗體檢測方法的建立.pdf

1、兔出血癥(RabbitHemorrhagicDisease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV)引起的家兔的一種高度接觸性、致死性傳染病，以肝細胞壞死、實質(zhì)臟器出現(xiàn)淤血及出血性變化、死亡率高等為特點，給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。噬菌體展示技術(shù)通過模擬配體-受體間的特異性結(jié)合作用而達到從噬菌體多肽文庫中篩選特異性配體的目的。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用在抗原表位篩選、疾病檢測、疫苗研究以及多

2、肽藥物篩選等方面。在抗原表位的研究中，主要使用親和篩選的方法，通過三到四輪親和篩選，有效富集特異性噬菌體克隆，獲得抗原模擬表位。
　　 本研究為獲得抗原RHDV的抗原表位，使用實驗室構(gòu)建的抗RHDV單抗A3c作為固相篩選分子，用噬菌體展示技術(shù)進行親和篩選。為獲得新型RHDV檢測方法，在親和篩選的基礎(chǔ)上，用篩選得到的噬菌體克隆作為模擬抗原，建立了檢測兔血清中RHDV抗體的間接ELISA方法?？乖砦坏难芯繛镽HDV分子生物學的進一

3、步研究和新型疫苗的探索提供基礎(chǔ)，而間接ELISA方法的建立為兔場免疫效果的評價和流行病學調(diào)查提供了有利工具。
　　 具體試驗內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.RHDV抗原模擬表位的篩選。復(fù)蘇實驗室保存的RHDV單抗A3c雜交瘤細胞系，并制備腹水型單抗。單抗純化后測定其純度、濃度、效價及親和常數(shù)。用高活性、高純度的單抗作為固相篩選分子，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)進行親和篩選，對篩選的噬菌體克隆進行鑒定并測序，獲得與抗原高度同源的序列，即

4、抗原的表位。結(jié)果表明，制備的單抗經(jīng)純化后純度高于80％，ELISA效價為1∶81920，親和常數(shù)為3.5×107，具有較高的純度和活性，可以用作固相親和篩選。經(jīng)過三輪親和篩選，有效富集了特異性噬菌體克隆。用夾心ELISA方法鑒定，結(jié)果表明25個噬菌體克隆中19個為陽性克隆。競爭ELISA方法進一步驗證了這些克隆與單抗的結(jié)合具有特異性。接下來對陽性噬菌體克隆進行測序，結(jié)果表明，獲得了與抗原高度同源的序列GTDDMDPGTTAA，即抗原的模

5、擬表位。其中，氨基酸基序DXXDP為表位中的核心氨基酸。
　　 2.應(yīng)用親和篩選得到的陽性噬菌體克隆K1作為模擬抗原，建立檢測兔出血癥病毒抗體的間接ELISA方法。本研究對ELISA的各個反應(yīng)條件進行優(yōu)化，測定該方法的特異性、靈敏性、重復(fù)性以及包被的酶標板的保存期，并用該方法檢測了100份兔血清中抗體水平。實驗結(jié)果表明，該方法中噬菌體的最佳包被濃度為1.56×107pfu/ml，血清的最佳稀釋度為1∶200，5％BSA為最適封閉

6、液，酶標二抗的最佳稀釋度為1∶5000，封閉液的封閉時間、抗原抗體作用時間、酶標二抗作用時間以及底物的顯色時間分別為90min、30min、30min和10min。應(yīng)用該方法檢測100份兔血清中的RHDV抗體水平，其中陽性樣品數(shù)為86(86％)，而用實驗室建立的RHDVVP60蛋白間接ELISA方法檢測，陽性樣品數(shù)為73(73％)。比較兩種檢測方法，符合率為85％。因此，該ELISA方法特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便，適用于臨床