四種重要養(yǎng)殖貝類有效繁殖群體數(shù)量研究.pdf

1、我國(guó)是海水養(yǎng)殖大國(guó),海洋貝類的養(yǎng)殖是其中重要的組成部分。對(duì)于養(yǎng)殖群體來(lái)說(shuō),較低的有效群體大小(或有效繁殖群體大小)會(huì)使得群體的遺傳多樣性降低,增加近交和遺傳漂變的比率,特別在貝類等高產(chǎn)卵能力的生物中,使用較少的親本即可以獲得足夠的苗種,育苗所用的有效繁殖群體數(shù)量對(duì)養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)具有重要影響。本研究以分子遺傳學(xué)理論為基礎(chǔ),在貝類中進(jìn)行遺傳標(biāo)記的開(kāi)發(fā)并檢測(cè)了他們?cè)诩蚁佃b定中的效率。此外,應(yīng)用分子家系鑒定的方法,調(diào)查了北方沿海四種具有不同

2、生活方式的重要經(jīng)濟(jì)貝類:太平洋牡蠣(固著型),海灣扇貝(雌雄同體底棲型),蝦夷扇貝(雌雄異體底棲型),魁蚶(埋棲型)等在常規(guī)苗種繁育過(guò)程中有效繁殖群體的大小、遺傳多樣性的變化以及近交程度,旨在為我國(guó)海水養(yǎng)殖貝類遺傳多樣性保護(hù)和健康苗種培育提供指導(dǎo)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.海灣扇貝EST-SSR標(biāo)記分離及特性分析
　　 利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源,在海灣扇貝EST數(shù)據(jù)庫(kù)中查找包含微衛(wèi)星的序列,開(kāi)發(fā)了15個(gè)EST-SSR分

3、子標(biāo)記,采用群體多態(tài)性分析結(jié)果顯示,位點(diǎn)的等位基因數(shù)平均值為5.5,觀測(cè)和期望雜合度范圍分別為0.000-0.781和0.155-0.885。平均多態(tài)信息含量為0.548。進(jìn)行Bonferroni校正后,發(fā)現(xiàn)15個(gè)位點(diǎn)中有8個(gè)位點(diǎn)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡。在各位點(diǎn)之間未發(fā)現(xiàn)有連鎖現(xiàn)象。5個(gè)多態(tài)性最高的微衛(wèi)星位點(diǎn)在己知單親時(shí)的累積排除概率超過(guò)99％。利用篩選出的15對(duì)引物在櫛孔扇貝、蝦夷扇貝和長(zhǎng)肋日月貝中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中9對(duì)引物在櫛孔

4、扇貝和蝦夷扇貝中能擴(kuò)增出產(chǎn)物,有5對(duì)引物擴(kuò)出的微衛(wèi)星標(biāo)記呈多態(tài)。在長(zhǎng)肋日月貝中有3對(duì)引物有擴(kuò)增產(chǎn)物,有1對(duì)引物擴(kuò)出的微衛(wèi)星標(biāo)記呈多態(tài)。
　　 2.海灣扇貝EST-SNP標(biāo)記分離及特性分析
　　 通過(guò)對(duì)海灣扇貝EST數(shù)據(jù)庫(kù)中4968條ESTs進(jìn)行聚類及拼接后,共發(fā)現(xiàn)3905個(gè)候選SNP位點(diǎn),平均密度為1/118.2bp。從中選擇30個(gè)候選SNPs進(jìn)行tetra-primer ARMS-PCR引物設(shè)計(jì)和優(yōu)化,17組引物擴(kuò)增產(chǎn)

5、生與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符的多態(tài)性位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)最小等位基因頻率從0.016到0.484。對(duì)含有17個(gè)多態(tài)SNPs的contigs序列在GenBank中進(jìn)行BLASTX比對(duì),除一個(gè)位點(diǎn)所在序列外均有匹配的功能序列,其中11個(gè)已驗(yàn)證SNPs定位于編碼區(qū)(外顯子區(qū)),導(dǎo)致同義氨基酸替換。家系模擬鑒定結(jié)果表明,SNP標(biāo)記對(duì)鑒定所用親本的數(shù)量比微衛(wèi)星標(biāo)記更為敏感,因此需要更多的SNPs來(lái)抵消多態(tài)性低帶來(lái)的負(fù)面效果以達(dá)到較高并且穩(wěn)定性較好的鑒定成功率

6、。通過(guò)對(duì)海灣扇貝EST數(shù)據(jù)庫(kù)的分析構(gòu)建了最優(yōu)密碼子使用表,以解釋某一特定SNP不同等位基因頻率上的差異,分析發(fā)現(xiàn)對(duì)密碼子使用的選擇性可能會(huì)影響編碼區(qū)SNP不同等位基因的頻率。這些對(duì)于海灣扇貝SNP的初步研究是對(duì)現(xiàn)有遺傳標(biāo)記的有用補(bǔ)充。
　　 3.基于微衛(wèi)星家系分析的海灣扇貝交配系統(tǒng)和繁殖成功研究
　　 運(yùn)用微衛(wèi)星家系鑒定的方法對(duì)群體產(chǎn)卵海灣扇貝的交配系統(tǒng)進(jìn)行了研究。對(duì)14個(gè)候選親本和237個(gè)子代的鑒定結(jié)果表明,采用6個(gè)多

7、態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)能夠?qū)?5％的子代鑒定到親本。根據(jù)家系鑒定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)既有通過(guò)自體受精產(chǎn)生的子代也有通過(guò)非自體受精產(chǎn)生的子代,但是自體受精率在親本個(gè)體間巨大的變異表明海灣扇貝具有混合交配模式。繁殖成功的變異造成了有效繁殖親本數(shù)量的降低(Nb/N=0.71)。群體的自體受精率為32.89％,近交系數(shù)為16.5％。在不考慮自交子代的情況下,半同胞和非同胞親本在親緣關(guān)系和繁殖成功之間沒(méi)有顯著的相關(guān)關(guān)系,表明可能是選擇的壓力而不是對(duì)近交的避免機(jī)制支持

8、著海灣扇貝自交兼容性交配系統(tǒng)的進(jìn)化和維持。本研究結(jié)果使我們對(duì)目前我國(guó)海灣扇貝的養(yǎng)殖狀況有了深入了解,并且為以后對(duì)其進(jìn)行繁殖技術(shù)改良提供了知識(shí)基礎(chǔ)。
　　 4.太平洋牡蠣EST-SSR多重PCR的開(kāi)發(fā)及其在家系鑒定中的檢驗(yàn)
　　 我們從以往報(bào)道的太平洋牡蠣EST-SSRs中開(kāi)發(fā)出了4組multiplex PCRs,并在12組單對(duì)交配家系中檢驗(yàn)了其在家系鑒定中的效率。位點(diǎn)的基因豐富度和多態(tài)信息含量平均值分別為11.1和0.8

9、11,4組multiplex PCRs在家系鑒定中的累積排除能力大于99.99％。對(duì)143組分離模式的分析發(fā)現(xiàn),有11個(gè)基因型分離比偏離孟德?tīng)柗蛛x定律。通過(guò)分析位點(diǎn)在家系內(nèi)的Mendelian分離模式,發(fā)現(xiàn)無(wú)效等位基因頻率為4.9％。對(duì)12組單對(duì)交配家系的實(shí)際鑒定結(jié)果表明,使用2組多態(tài)信息含量最高的Multiplex PCRs,可以將97％的子代鑒定到親本,其結(jié)果與真實(shí)的家系信息對(duì)比,錯(cuò)誤率為4％;如果使用3組或者4組Multiplex

10、PCRs,則可以將100％的子代鑒定到親本,與真實(shí)的家系信息對(duì)比錯(cuò)誤率為0。
　　 5.太平洋牡蠣養(yǎng)殖群體的微衛(wèi)星家系分析和有效群體大小估算
　　 運(yùn)用7個(gè)高度多態(tài)的微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)群體產(chǎn)卵的太平洋牡蠣進(jìn)行家系分析,并比較親本和子代的遺傳多樣性變化。對(duì)8個(gè)候選母本、6個(gè)候選父本和155個(gè)子代的鑒定結(jié)果與模擬鑒定一致,運(yùn)用6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)即可獲得超過(guò)99％的鑒定成功率。等位基因數(shù)和觀察雜合度(Ho)在親本和子代中沒(méi)有明顯差異,但

11、是,子代的期望雜合度(He)和親本相比有顯著降低。雖然所有親本均參與子代繁殖過(guò)程,但是親本繁殖成功的變異和不平衡的性別比例導(dǎo)致了Ne的降低(Ne=11.42)。群體近交率的估算值為16.5％。這些結(jié)果表明在未來(lái)制定太平洋牡蠣群產(chǎn)育種方案時(shí),需要考慮到較高的近交率和較低有效群體的因素。
　　 6.基于微衛(wèi)星家系分析的蝦夷扇貝有效繁殖群體研究
　　 運(yùn)用微衛(wèi)星家系鑒定的方法對(duì)群體產(chǎn)卵蝦夷扇貝幼蟲(chóng)發(fā)育兩個(gè)不同時(shí)期的有效繁殖群體

12、的變化及其與親本性狀特征的相關(guān)性進(jìn)行了研究。對(duì)14個(gè)候選母本、14個(gè)候選父本和1080個(gè)子代的鑒定結(jié)果表明,采用5個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)能夠獲得97％以上的鑒定成功率。親本繁殖成功的變異是D形幼蟲(chóng)時(shí)期有效群體大小降低的主要原因(Ne/N=0.87),近交率的估計(jì)為0.081。稚貝時(shí)期的有效群體大小進(jìn)一步降低(Ne/N=0.78),近交率上升至0.090。這一變化可能與育苗過(guò)程中的幼蟲(chóng)分級(jí)選擇有關(guān),人為的改變了群體的遺傳結(jié)構(gòu),加劇了親本繁殖成功

13、的變異。也可能與不同親本組子代的存活力差異有關(guān)?；貧w分析表明,D形幼蟲(chóng)階段母本的繁殖成功與母本殼長(zhǎng)和殼寬存在顯著正相關(guān)關(guān)系,父本的繁殖成功與父本殼高存在顯著正相關(guān)關(guān)系,由此推斷在群體產(chǎn)卵時(shí),親本個(gè)體大小在繁殖成功上有顯著優(yōu)勢(shì)。然而在稚貝階段,未檢測(cè)到親本的繁殖成功與性狀特點(diǎn)的相關(guān)性。表明隨著苗種的養(yǎng)成,親本個(gè)體大小在產(chǎn)卵階段的繁殖成功優(yōu)勢(shì)司能會(huì)逐漸消失。
　　 7.基于微衛(wèi)星同胞重建的魁蚶有效繁殖群體研究
　　 運(yùn)用5個(gè)

14、微衛(wèi)星標(biāo)記,在沒(méi)有親本信息的情況下,采取同胞重建的方法研究了群體產(chǎn)卵魁蚶幼蟲(chóng)發(fā)育兩個(gè)不同時(shí)期遺傳多樣性以及有效繁殖群體大小的變化,并對(duì)親本的繁殖成功與交配對(duì)象數(shù)目的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)性研究。等位基因數(shù)和觀察雜合度在兩個(gè)采樣階段均沒(méi)有顯著差異。但是對(duì)D形幼蟲(chóng)時(shí)期以及稚貝時(shí)期各180個(gè)個(gè)體的同胞重建結(jié)果表明,D形幼蟲(chóng)時(shí)期有效繁殖群體的估算值為20,稚貝時(shí)期有效繁殖群體的估算值為16,出現(xiàn)了明顯的降低,而且稚貝時(shí)期可能的親本數(shù)量也比D形幼蟲(chóng)時(shí)期降

15、低了16.13％,△F增加了0.6％。多配繁殖在父/母本中均存在,而且在兩個(gè)采樣階段,魁蚶父/母本繁殖成功與交配對(duì)象數(shù)量均存在顯著正相關(guān)關(guān)系。
　　 綜上,本研究證明基于微衛(wèi)星的家系分析方法具有較高的鑒定效力。運(yùn)用5-6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)即能夠成功地對(duì)混合種群進(jìn)行家系鑒定。在本研究的所有養(yǎng)殖貝類中均檢測(cè)到有效繁殖群體數(shù)量(Nb,或有效種群大小Nc)的降低。交配系統(tǒng),不平衡的性別比例,親本貢獻(xiàn)的高度變異以及家系規(guī)模的變異是導(dǎo)致Nb降低的