大豆NBS類抗病基因同源片段的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究.pdf

1、大豆不僅是重要的高蛋白飼料與油料作物，在我國(guó)更是一種傳統(tǒng)的美食，其豐富多樣的豆類食品深受人們的喜愛(ài)，成為大眾生活中必不可缺的重要食物。歷來(lái)多種病蟲(chóng)害嚴(yán)重地影響了大豆的品質(zhì)與產(chǎn)量，加之外來(lái)轉(zhuǎn)基因大豆大量入侵使得我國(guó)本土大豆工業(yè)面臨了巨大的挑戰(zhàn)。NBS類抗病基因在植物抗病基因組中含量較多而且具有保守的結(jié)構(gòu)域，為其從大豆中克隆出這類抗病基因提供了可能，從抗病性強(qiáng)、蛋白高的地方大豆中克隆出抗病基因轉(zhuǎn)入其他基因型品種對(duì)于研究NBS結(jié)構(gòu)域的功能及抗

2、病機(jī)理、抗病基因的連鎖定位、大豆抗病育種有重要的意義。研究結(jié)果如下：
　　1. NBS類抗病基因同源片段的克?。焊鶕?jù)抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)3對(duì)簡(jiǎn)并引物通過(guò)RT-PCR，從湖南黑豆與福建黑豆的cDNA中擴(kuò)增出100多個(gè)克隆，測(cè)序鑒定出2個(gè)有通讀閱讀框并且具有NBS結(jié)構(gòu)域的片段：FNBS1、FNBS3。FNBS1大小為534bp，編碼181個(gè)氨基酸，包含P—loop、kinase--2、HD等結(jié)構(gòu)域；FNBS3大小為513bp，編碼1

3、69個(gè)氨基酸，包含P—loop、HD等結(jié)構(gòu)域，2個(gè)片段均具有NB-ARC結(jié)構(gòu)域（在植物中與抗病有關(guān)），F(xiàn)NBS1與大豆抗病蛋白R(shí)PM1同源性為97%，F(xiàn)NBS3與大豆抗TMV蛋白的同源性為99%。
　　2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化：本實(shí)驗(yàn)研究了不同基因型、不同的器官、抗氧化劑等因素對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響，對(duì)大豆的轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)對(duì)3個(gè)不同基因型的叢芽發(fā)生能力的比較發(fā)現(xiàn)湖南青豆的叢芽率最高達(dá)到60%，平均叢芽發(fā)生能力大于3；對(duì)

4、比福建青豆不同的器官發(fā)現(xiàn)子葉節(jié)的叢芽率最高達(dá)到35%；在研究抗氧化劑對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加適量的抗氧化劑能明顯提高GUS瞬間表達(dá)率，從15.2%顯著提高到40.8%，而且能有效地抑制浸染過(guò)程外植體傷口處的褐化與組織的死亡。
　　3.大豆 NBS類抗病基因同源片段的遺傳轉(zhuǎn)化：構(gòu)建了植物表達(dá)載體pFGC5941-NBS，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆與煙草，得到了大豆轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗2株，轉(zhuǎn)化率為1.08%，得到煙草轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗15株，