奶牛乳腺中小肽的攝取及其在乳蛋白合成中的作用.pdf

1、乳腺用于乳蛋白合成的主要源料是氨基酸，然而氨基酸營養(yǎng)并不是乳腺蛋白質(zhì)營養(yǎng)的全部，血液循環(huán)中的小肽很可能參與了乳蛋白的合成。本研究利用奶牛乳腺組織/細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，研究了不同的氨基酸配比和小肽對奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的影響(試驗一)；小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體在乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控及其在乳腺小肽攝取中的作用(試驗二)；以及小肽促進(jìn)乳蛋白合成的分子機(jī)制(試驗三)。
　　 試驗一不同的氨基酸配比和小肽對乳蛋白合成的影響
　　 本研

2、究利用乳腺組織體外培養(yǎng)模型研究了必需氨基酸配比和小肽對乳蛋白合成的影響。首先，探索維持貼壁培養(yǎng)乳腺組織泌乳的條件，在乳腺組織培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的催乳素、胰島素、氫化可的松及其不同組合，檢測激素對乳蛋白合成的影響。在此基礎(chǔ)上，探討蘇氨酸(Thr)與苯丙氨酸(Phe)比例對乳蛋白合成的影響，進(jìn)一步完善乳腺組織體外培養(yǎng)所需的氨基酸配比模式。然后，探討Phe和賴氨酸(Lys)小肽數(shù)量及其氨基酸殘基性質(zhì)對乳蛋白合成的影響。結(jié)果表明，添加適宜

3、濃度的泌乳相關(guān)激素能促進(jìn)乳蛋白的合成，催乳素、胰島素和氫化可的松的添加濃度分別為500 ng/mL、5000 ng/mL和1000 ng/mL時，αs1酪蛋白基因表達(dá)或乳蛋白合成顯著增加(P<0.05)。改變培養(yǎng)液中Thr與Phe的比例能影響αs1酪蛋白基因表達(dá)和乳蛋白合成，當(dāng)兩者比例為1∶1時，αs1酪蛋白基因表達(dá)豐度和培養(yǎng)液中乳蛋白含量最高。添加Phe和Lys小肽能影響乳蛋白的合成，不同的小肽添加比例及其氨基酸殘基組成對乳蛋白合成有

4、不同的影響。當(dāng)Phe-Phe、Phe-Thr和Thr-Phe-Phe添加比例為10％，Lys-組氨酸(His)、Lys-Phe、Lys-Lys、Lys-亮氨酸(Leu)和Lys-Thr添加比例分別為15％、10％、5％、5％和5％時，αs1酪蛋白mRNA水平達(dá)到最高(P<0.05)。與由親水性和帶電荷的氨基酸殘基組成的小肽相比，由疏水性和體積較大的氨基酸殘基組成的小肽對乳蛋白合成的促進(jìn)作用更大。以上結(jié)果表明，適宜的泌乳相關(guān)激素濃度和必需

5、氨基酸比例能促進(jìn)乳蛋白的合成；奶牛乳腺能攝取一定量的Phe和Lys小肽用于乳蛋白的合成，且其利用效率高于相應(yīng)的氨基酸。
　　 試驗二乳腺上皮細(xì)胞中小肽的攝取機(jī)理
　　 為揭示乳腺攝取小肽的分子機(jī)理，本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法研究小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PepT)在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其調(diào)控規(guī)律，探討其在乳腺中的可能作用。并添加小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體功能抑制劑焦碳酸二乙酯(DEPC)，檢測小肽轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷

6、對乳蛋白合成的影響，試圖揭示小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體在乳腺小肽攝取過程中的作用。結(jié)果表明，奶牛乳腺組織中PepT2基因表達(dá)水平較高，在乳腺腺泡上皮細(xì)胞中能檢測到PepT2蛋白表達(dá)，但沒有檢測到PepT1表達(dá)。PepT2基因表達(dá)受泌乳相關(guān)激素的調(diào)控，添加50 ng/mL、500 ng/mL和5000 ng/mL的催乳素、100 ng/mL，氫化可的松及50 ng/mL、500 ng/mL、5000ng/mL和50000 ng/mL的胰島素均可顯著提高

7、PepT2的mRNA豐度(P<0.05)。Phe小肽可以促進(jìn)PepT2的基因表達(dá)，但其mRNA豐度并不隨Phe小肽濃度的增加而無限提高。與對照組相比，添加5％和10％的Phe-Phe及5％、10％和15％的Thr-Phe-Phe均可顯著提高PepT2的mRNA豐度(P<0.05)。當(dāng)Phe-Thr添加比例為10％時，乳腺中PepT2的基因表達(dá)有增加的趨勢(P=0.064)。比較三種不同的Phe小肽發(fā)現(xiàn)，小肽中的氨基酸殘基不同，對PepT

8、2的影響不同，Phe-Phe和Thr-Phe-Phe比等量的Phe-Thr對PepT2基因表達(dá)的促進(jìn)作用更大(P<0.05)。10％Phe-Phe的添加顯著增加了αs1酪蛋白和PepT2的mRNA豐度以及培養(yǎng)液中總蛋白含量(P<0.05)，但對二肽水解酶DPEP2基因表達(dá)沒有影響。而抑制PepT2轉(zhuǎn)運(yùn)功能(添加0.5 mM的DEPC)則降低了Phe-Phe對αs1酪蛋白基因表達(dá)和乳蛋白合成的促進(jìn)作用(P<0.05)。以上結(jié)果提示，奶牛乳

9、腺中有小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2表達(dá)，且其表達(dá)受泌乳相關(guān)激素和底物小肽的調(diào)控；抑制PepT2轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低了小肽對乳蛋白合成的促進(jìn)作用，PepT2在乳腺小肽攝取過程中發(fā)揮積極作用。
　　 試驗三小肽影響乳蛋白合成的分子機(jī)制的研究
　　 為探討小肽在乳蛋白合成中的營養(yǎng)作用和調(diào)控作用，本研究檢測了小肽對乳腺上皮細(xì)胞氨基酸攝取以及細(xì)胞膜上多種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響，并研究了不同Lys二肽對mTOR信號通路中三種信號因子(mTOR、4E

10、-BP1和S6K1)基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Phe-Phe的添加顯著增加了αs1酪蛋白、ATB0+和y+CAT2的mRNA豐度以及培養(yǎng)液中Lys、Phe、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val)的消失率(P<0.05)。Lys二肽替代Lys廣泛促進(jìn)了ATB0+的基因表達(dá)。除Lys-Phe二肽外，Lys-His、Lys-Leu、Lys-Thr和Lys-Lys的添加均提高了ATB0+的mRNA水平(P<0.01)。Lys-H

11、is和Lys-Lys均能顯著提高mTOR、4E-BP1和S6K1的mRNA豐度(P<0.05)。這些結(jié)果說明，添加小肽能減少氨基酸之間的吸收競爭，促進(jìn)乳腺對氨基酸的攝??；除作為底物促進(jìn)乳腺氨基酸攝取和乳蛋白合成外，小肽也可作為信號分子參與乳蛋白合成。
　　 綜上所述，適宜的泌乳相關(guān)激素濃度和必需氨基酸比例能誘導(dǎo)和維持體外培養(yǎng)的乳腺組織塊中乳蛋白的合成，奶牛乳腺能攝取一定量的Phe和Lys小肽用于乳蛋白的合成，且其利用效率高于相應(yīng)