甘草細(xì)胞放大培養(yǎng)的過程工程研究.pdf

1、甘草是中成藥及配方制劑中用量最大的一味藥，居國藥之首，素有“十方九草”之說。甘草的化學(xué)成分復(fù)雜，具有多種生物學(xué)與藥理學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品等行業(yè)。近年來野生甘草面臨嚴(yán)重的資源問題，而栽培品種周期長、品質(zhì)低。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)直接生產(chǎn)植物有效成分是解決野生植物資源短缺有效的方法之一。在實(shí)際培養(yǎng)過程中，尚存在很多需要解決的問題，本文以脹果甘草為材料，對甘草細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分的可行性、關(guān)鍵問題如甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的優(yōu)化

2、控制及反應(yīng)器放大培養(yǎng)等方面開展了較為系統(tǒng)的研究，取得了以下的研究成果：
　?。?）系統(tǒng)分析了脹果甘草懸浮細(xì)胞合成的次生代謝產(chǎn)物。利用HPLC指紋圖譜結(jié)合相似度評價(jià)系統(tǒng)，構(gòu)建了脹果甘草懸浮細(xì)胞提取物的指紋圖譜，標(biāo)定指紋峰22個(gè)，與野生甘草提取物的指紋圖譜相似度為58.4％；并建立了懸浮細(xì)胞中黃酮類化合物的指紋圖譜，標(biāo)定指紋峰16個(gè)，與野生甘草中黃酮類化合物指紋圖譜相似度為75.2%，采用LC-ESI-MS技術(shù)初步確定兩個(gè)主要黃酮類指

3、紋峰分別為甘草苷與甘草素，同時(shí)分別采用HPLC和LC-MS/MS技術(shù)檢測了懸浮細(xì)胞中查爾酮A和甘草酸的合成。
　?。?）研究了甘草細(xì)胞懸浮體系中酶促褐化反應(yīng)發(fā)生的機(jī)理及其有效控制策略。甘草細(xì)胞固-液轉(zhuǎn)化后受到液體懸浮環(huán)境的滲透脅迫和流體剪切壓力，引起細(xì)胞膜受傷，導(dǎo)致酚類化合物和多酚氧化酶結(jié)合造成酶促褐化的發(fā)生。對于甘草細(xì)胞來說，比較有潛力的PPO抑制劑是抗壞血酸和L-半胱氨酸，當(dāng)0.1 mM的這兩種抑制劑分別被添加到懸浮體系中，褐

4、化現(xiàn)象明顯得到控制，細(xì)胞活力得到維持。
　?。?）分析了甘草細(xì)胞懸浮體系的流變學(xué)特性。獲得不同發(fā)酵時(shí)間的流變參數(shù)，建立流變本構(gòu)方程，為甘草細(xì)胞放大培養(yǎng)過程的優(yōu)化操作以及相關(guān)的反應(yīng)器設(shè)計(jì)和改造提供參考。
　?。?）建立了甘草細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中的放大培養(yǎng)工藝。并對甘草細(xì)胞在反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)的基本特性進(jìn)行了研究，評價(jià)了反應(yīng)器特有條件下，細(xì)胞活力、生物量積累、過氧化氫產(chǎn)量和甘草黃酮合成的變化情況。分別以單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)所得

5、數(shù)據(jù)為樣本，運(yùn)用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合遺傳算法獲得反應(yīng)器中細(xì)胞生長的最佳操作參數(shù)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這種基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合遺傳算法的優(yōu)化方法與傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)方法相比，反應(yīng)器中細(xì)胞的生物量積累提高了6.9%。
　?。?）建立了根癌由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的脹果甘草懸浮細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化體系。并利用該體系，將黃酮類合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶基因-查爾酮異構(gòu)酶基因，通過構(gòu)建過表達(dá)的pCAMBIA1303-chi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到脹果甘草懸浮細(xì)胞中，得到一個(gè)穩(wěn)定的、過表達(dá)chi