豬OAS1啟動(dòng)子SNP對(duì)日本乙型腦炎病毒感染的影響.pdf

1、流行性乙型腦炎（Japaneseencephalitis，JE，簡(jiǎn)稱乙腦）是由日本乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)感染所引發(fā)的一種人畜共患病，乙腦主要流行于東南亞地區(qū)，我國(guó)屬于乙腦的高發(fā)地區(qū)。人感染乙腦主要出現(xiàn)腦炎癥狀，而豬感染會(huì)導(dǎo)致母豬流產(chǎn)和公豬睪丸炎，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成極大危害。JEV在動(dòng)物與人之間循環(huán)傳播，帶毒蚊子通過(guò)叮咬將JEV傳播給人。豬是JEV的中間宿主和傳播宿主，在乙腦的傳播過(guò)程中起到重

2、要作用，因此對(duì)于預(yù)防豬感染JEV在乙腦防治工作中具有重要意義。
　　2'-5'寡腺苷酸合成酶(2'-5'oligoadenylatesynthetases，OAS)家族屬于不依賴模板的RNA聚合酶家族，是干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白。OAS識(shí)別并結(jié)合病毒的雙鏈RNA，合成2'-5'寡腺苷酸(2-5A)，依次結(jié)合并激活潛在的RNaseL，降解細(xì)胞內(nèi)RNA和病毒RNA，抑制蛋白質(zhì)的合成，這是經(jīng)典的OAS/RNaseL途徑，此外OAS還存在不

3、依賴于RNaseL的抗病毒途徑。自發(fā)現(xiàn)小鼠mOAS1b基因?yàn)閃NV的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志基因以來(lái)，已報(bào)道OAS具有抑制腦心肌炎病毒、水皰性口炎病毒(VSV)、羅斯河病毒等多種病毒增殖的作用。人的OAS基因已被證實(shí)與西尼羅病毒(WNV)、丙型肝炎病毒(HCV)和SARS冠狀病毒的易感性有關(guān)。研究表明馬的OAS1啟動(dòng)子區(qū)SNP與個(gè)體WNV的易感性密切相關(guān)。
　　介于目前尚無(wú)宿主遺傳因素與JEV易感性的相關(guān)性研究。本研究目的是通過(guò)分析自然感染JEV

4、發(fā)病豬與健康豬OAS1啟動(dòng)子基因序列的差異，研究豬OAS1單核苷酸多態(tài)性(SNP)與豬感染JEV發(fā)病表型的相關(guān)性。通過(guò)構(gòu)建豬OAS1的真核表達(dá)載體，分析胞內(nèi)pOAS1抗JEV感染作用，揭示豬OAS1基因是否為豬感染乙腦的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志基因。本研究主要從以下幾個(gè)方面開(kāi)展。
　　1.豬源OAS1啟動(dòng)子的定位與功能測(cè)試
　　本研究通過(guò)軟件對(duì)比分析豬基因組序列(NC_010456)、pOAS1mRNA(NM_214303.1)和EST信息

5、，確定豬OAS1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是-155nt(ORF+1ATG)。應(yīng)用啟動(dòng)子分析軟件，對(duì)比人和小鼠的OAS1啟動(dòng)子序列特征，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增OAS1啟動(dòng)子區(qū)。通過(guò)pGL3-Basic啟動(dòng)子活性檢測(cè)載體，確定-1274至-34位的1241nt為豬OAS1的啟動(dòng)子區(qū)域，并通過(guò)設(shè)計(jì)該啟動(dòng)子區(qū)的分段引物連接載體。經(jīng)干擾素刺激轉(zhuǎn)染啟動(dòng)子測(cè)試載體的細(xì)胞，定位OAS1啟動(dòng)子的干擾素應(yīng)答核心區(qū)域?yàn)?289至-34，256bp。通過(guò)對(duì)該區(qū)域的定點(diǎn)突變

6、，確定了OAS1核心啟動(dòng)子區(qū)的2個(gè)ISRE/IRF結(jié)合位點(diǎn)。該研究為OAS基因啟動(dòng)子的分析及功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2.豬源OAS1核心啟動(dòng)子區(qū)SNP特征
　　本研究對(duì)收集的乙型腦炎發(fā)病豬、同群健康豬，地方和引進(jìn)品種豬樣品的OAS1核心啟動(dòng)子區(qū)的基因序列進(jìn)行分析，證實(shí)豬OAS1啟動(dòng)子區(qū)的存在5個(gè)SNP位點(diǎn)的基因多態(tài)性，不同品種豬的SNP具有特征性。對(duì)發(fā)病豬與健康豬的OAS1核心啟動(dòng)子區(qū)的序列比較發(fā)現(xiàn)，在OAS1啟動(dòng)子區(qū)的-

7、60位(C→A)和-264位(T→G)發(fā)病豬突變率高。通過(guò)比較SNP差異的乙腦發(fā)病豬與健康豬OAS1啟動(dòng)子活性的差異發(fā)現(xiàn)，無(wú)論6h還是24h乙腦發(fā)病豬啟動(dòng)子的基礎(chǔ)活性都高于健康豬，但對(duì)干擾素應(yīng)答的強(qiáng)度低于健康豬。乙腦發(fā)病豬單個(gè)SNP導(dǎo)致其對(duì)干擾素應(yīng)答強(qiáng)度的降低。
　　3.豬源OAS1在抗JEV感染中作用的初步探究
　　本研究檢測(cè)干擾素刺激對(duì)乙腦病毒增殖的影響和OAS1表達(dá)量的變化，以及比較乙腦病毒強(qiáng)毒株和弱毒株分別刺激PK細(xì)

8、胞后OAS1表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，豬α干擾素明顯抑制JEV在PK15細(xì)胞上的增殖，并可誘導(dǎo)pOAS1的表達(dá)。JEV強(qiáng)毒株和弱毒株刺激PK細(xì)胞24h后，pOAS1的表達(dá)明顯上升，但表達(dá)量低于強(qiáng)毒株刺激。而pOAS1啟動(dòng)子活性經(jīng)JEV強(qiáng)毒株刺激6h活性上升，24h到達(dá)高峰，而弱毒株刺激6h啟動(dòng)子活性即到達(dá)高峰，24h活性下降。此外，同一毒株的接毒劑量對(duì)OAS1啟動(dòng)子活性和表達(dá)量的調(diào)控也有明顯差異，高劑量有抑制作用，低劑量不能有效激活。比較