DF-1細(xì)胞分泌的外源體(Exosomes)在ALV-J免疫抑制中的作用.pdf

1、J亞群禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus Subgroup J，ALV-J）是禽白血病/肉瘤病毒群的一個(gè)新亞群，是由英國人Payne 于1991 首次報(bào)道，其主要引起肉種雞的髓細(xì)胞瘤（Myelcytomatosis，ML）。近年來ALV-J 在世界范圍內(nèi)迅速傳播，尤其是在1997-1998年對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)造成了毀滅性的打擊。ALV-J是由內(nèi)源性和外源性禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus，ALV）重組

2、而來，自發(fā)現(xiàn)以來給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。ALV-J 除可導(dǎo)致ML 并引起感染雞群死亡外，更值得我們注意的是它的免疫抑制作用，這也是絕大數(shù)感染雞群的主要表現(xiàn)形式，由于ALV-J的感染，雞群的生產(chǎn)性能大為降低，對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答水平降低，導(dǎo)致繼發(fā)感染其它疾病，引起更重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)ALV-J 造成免疫抑制的機(jī)制及其相關(guān)影響因素的研究，對(duì)進(jìn)一步ALV-J的防控研究具有重要意義。
　　 自1987年Johnstone等人發(fā)現(xiàn)網(wǎng)

3、織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中釋放一種名為外源體（Exosome）的微囊泡之后，Exosome 已被越來越多的人進(jìn)行研究。Exosome來源于細(xì)胞內(nèi)吞途徑中的多囊體（Multivesicularbody，MVB），它除了可由網(wǎng)織紅細(xì)胞分泌之外，還可由諸如各種血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞（如黑色素瘤、肺癌、間皮瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病細(xì)胞）等多種細(xì)胞分泌。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)Exosomes的分泌與反轉(zhuǎn)錄病毒出芽之間存在一定的聯(lián)系，

4、例如人巨細(xì)胞病毒(HCMV)蛋白US28 主要存在于MVB中，通過HCMV 病毒裝配與病毒包膜組合在一起；HIV-1出芽依賴Tsg101(一種在MVB 形成過程中很重要的蛋白)。反轉(zhuǎn)錄病毒在漿膜向外出芽方式與MVB 向內(nèi)出芽一樣，都是胞膜包裹胞質(zhì)內(nèi)陷，這樣反轉(zhuǎn)錄病毒似乎與經(jīng)修飾的MVB 內(nèi)囊泡(比如Exosome)一樣，有可能通過MVB 與漿膜融合釋放到細(xì)胞外環(huán)境。于是，我們推測病毒感染細(xì)胞分泌的Exosome 可能攜帶了某些病毒蛋白，

5、在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中傳遞了病毒的組成成分，造成細(xì)胞對(duì)病毒識(shí)別的喪失，從而使病毒能夠順利的在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及傳播。
　　 本研究以ALV-J 為模式病毒，研究其感染細(xì)胞分泌的Exosome 在免疫抑制中的作用。采用分級(jí)離心和密度梯度離心的方法，從ALV-J 感染DF-1 細(xì)胞及正常DF-1細(xì)胞培養(yǎng)基中提取Exosomes，利用電鏡技術(shù)和免疫印跡分析對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，從DF-1 細(xì)胞培養(yǎng)基中提取的Exosomes 主要分布在1.13-

6、1.21g/ml 密度層之間，平均直徑在30-100 nm之間，呈杯狀，這與相關(guān)報(bào)道關(guān)于其它細(xì)胞分泌的Exosomes特征一致。分別提取等量兩種細(xì)胞上清液，經(jīng)BCA蛋白定量后發(fā)現(xiàn)ALV-J 感染Exosome 濃度為正常Exosome 濃度的63倍，表明ALV-J 感染對(duì)Exosome的分泌有重要影響。
　　 利用免疫印跡方法，分析DF-1 細(xì)胞釋放ALV-J 與其分泌Exosomes之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果顯示，從正常

7、DF-1 細(xì)胞和接種ALV-J的DF-1 細(xì)胞系培養(yǎng)基中提取的Exosomes蛋白組成復(fù)雜，蛋白分子量在20-200kD之間，兩種Exosome 成分之間有相同之處，但也存在差異；Hsp70等標(biāo)志性蛋白存在于所提取的Exosomes上；用兔抗ALV-J GP85多克隆抗體可以檢測到ALV-J 感染DF-1 細(xì)胞Exosome 出現(xiàn)陽性條帶，條帶分子量大小為70kD 左右，而DF-1 細(xì)胞上清液中提取的Exosome 檢測不到條帶，表明D

8、F-1 細(xì)胞分泌的Exosome 攜帶了病毒的SU蛋白或SU蛋白的一部分；ISU片段是TM 內(nèi)高度保守的免疫抑制序列，具有免疫抑制作用，能夠抑制淋巴細(xì)胞的分化，用兔抗ISU肽多克隆抗體正常DF-1 細(xì)胞Exosome和ALV-J 感染DF-1 細(xì)胞來源的Exosome 均可在74kD 左右出現(xiàn)陽性條帶，表明TM蛋白ISU 區(qū)域或能與ISU多肽結(jié)合的物質(zhì)也包含在Exosome的囊泡內(nèi)，而這種物質(zhì)是正常DF-1 細(xì)胞分泌的，ALV-J 感染