楊樹潰瘍病(Botryosphaeria dothidea)典型病斑的蛋白質(zhì)組學分析.pdf

1、楊樹是非常重要的用材林樹種。楊樹潰瘍病是危害楊樹枝干的主要病害之一，研究楊樹潰瘍病的致病機制有重大的經(jīng)濟和生態(tài)意義，蛋白質(zhì)組學作為后基因組時代的新興研究領(lǐng)域，是當今生物學研究中揭示物質(zhì)生命現(xiàn)象的重要手段，是林木生物學的重要內(nèi)容。對楊樹潰瘍病的典型病斑進行蛋白質(zhì)組學分析，對闡明楊樹潰瘍病的致病機制以及楊樹的抗病機制有重要的推動作用；也為其他林木與病原菌互作的蛋白質(zhì)組學研究提供了參考。本研究以野外采集的、9月份發(fā)病高峰期的107楊樹樹皮健康

2、組織和潰瘍病斑為實驗材料，建立了一種適合楊樹樹皮的蛋白質(zhì)提取方法，并運用蛋白質(zhì)組學方法對楊樹與潰瘍病菌互作所產(chǎn)生典型病斑的蛋白質(zhì)進行了分離和分析，對差異表達的蛋白點進行了質(zhì)譜鑒定和生物信息學分析，主要獲得以下研究結(jié)果：
　　 1.建立了一種適合楊樹樹皮蛋白質(zhì)的提取方法，針對蛋白質(zhì)提取過程中的樣品沉淀時間、所加裂解液的量和振蕩裂解時間，設置不同梯度，通過實驗反復驗證，確定了蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)沉淀時間為12h；每克樣品干粉中加入裂解液

3、的最優(yōu)量為500μL；最優(yōu)裂解時間為3h。確定了效果良好的等電點聚焦(IEF)程序參數(shù)：Grad500V，2h；Grad1000V，1h；Grad8000V，20000vh；Step8000V，60000vh；本研究選擇pH4-7、長度為24cm的膠條，濃度為12％分離膠分離楊樹樹皮蛋白，效果良好。
　　 2.通過對楊樹樹皮健康組織和病斑組織的雙向電泳圖譜進行分析，共發(fā)現(xiàn)54個差異表達的蛋白點，其中有21個是發(fā)生質(zhì)變的差異蛋白點

4、；有17個質(zhì)變的差異蛋白點為楊樹樹皮健康組織的蛋白質(zhì)凝膠圖譜所特有；剩余的5個質(zhì)變差異蛋白點為楊樹樹皮病斑組織的蛋白質(zhì)圖譜所有；有33個是發(fā)生量變的差異表達蛋白點，以健康楊樹樹皮的蛋白質(zhì)圖譜為對照，病斑組織蛋白質(zhì)圖譜有22個蛋白點的表達量上調(diào)，11個蛋白點的表達量下調(diào)。
　　 3.選擇其中的46個差異表達的蛋白點進行質(zhì)譜鑒定，通過Mascot軟件分析和數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果，確定了這些差異蛋白點的等電點和分子量等基本屬性，以檢測結(jié)果得分

5、≥73為標準，發(fā)現(xiàn)有21個蛋白點的檢測結(jié)果呈陽性，其中有6差異個蛋白點基本上得到明確的鑒定，其他大多為預測蛋白。這6個差異蛋白點分別是：抗壞血酸過氧化物酶(APX)、熱休克蛋白(HSP)、纖維素合成酶(CesA)、富含亮氨酸重復序列型受體蛋白激酶(LRR-RLK)、樹皮儲存蛋白(BSP)和烯醇化酶(enolase)。通過對這些差異蛋白點功能的分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白點主要涉及到楊樹的防御應答、信號傳導及調(diào)控、氨基酸代謝、能量代謝、轉(zhuǎn)錄等多