DHAV-1感染性克隆構(gòu)建及其部分生物學(xué)活性研究.pdf

1、A型鴨病毒性肝炎(TypeADuckviralhepatitis)是由鴨甲肝病毒(duckhepatitisAvirus，DHAV)感染導(dǎo)致的急性和高度致死性傳染病，主要感染1～3周齡雛鴨，死亡率高達(dá)90％以上，該病有3個(gè)血清型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，3個(gè)型有著明顯的差異，交叉免疫性差。其中DHAV-1型鴨病毒性肝炎呈世界性分布，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一。本研究構(gòu)建了DHAV-1LY0802株的傳染性克隆，并

2、對(duì)其部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。
　　 1、DHAV-1LY0802株的傳染性克隆的構(gòu)建及病毒拯救
　　 參照GenBank上公布的序列設(shè)計(jì)9對(duì)引物，通過(guò)RT-PCR的方法獲得從鴨群中分離到的DHAV-1LY0802株的忠實(shí)cDNA。其中采用RACE方法分別對(duì)5’端和3’端未知序列進(jìn)行測(cè)定。測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的序列比較后發(fā)現(xiàn)，同源性高達(dá)93.2％～95.2％。
　　 參考載體pCDNA3.1與病毒序列中酶

3、切位點(diǎn)的位置，設(shè)計(jì)5對(duì)引物，將DHAV全基因組分為5個(gè)片段定向裝配到載體上。通過(guò)引物設(shè)計(jì)的方法，在cDNA的5’端添加sp6啟動(dòng)子和3'端添加親本病毒序列中不存在的酶切位點(diǎn)XhoⅠ后，按照順序?qū)⑵溲b配到pCDNA3.1載體上。通過(guò)點(diǎn)突變的方法優(yōu)化序列最前端的AUG環(huán)境，并以此作為遺傳標(biāo)記以區(qū)別母本病毒與拯救病毒。
　　 按照既定順序?qū)Y0802株全長(zhǎng)cDNA按順序連接到pCDNA3.1載體上獲得陽(yáng)性重組子pLYDHAV，序列測(cè)

4、定后發(fā)現(xiàn)有7位堿基發(fā)生突變，其中第13、19位堿基為人工誘變，用于優(yōu)化AUG環(huán)境和作為遺傳標(biāo)記。變異堿基造成第5、7位氨基酸序列發(fā)生突變，其余突變均為無(wú)義突變。
　　 用XhoⅠ酶切重組質(zhì)粒pLYDHAV進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄后立即用于轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，并以母本RNA作陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌PBS作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，且用RT-PCR方法和IFA方法檢測(cè)均為陽(yáng)性結(jié)果。經(jīng)過(guò)遺傳標(biāo)記的鑒定，表明造成細(xì)胞病變的是拯

5、救病毒而非感染野毒。
　　 2、拯救病毒的部分生物學(xué)特性研究
　　 分別在轉(zhuǎn)染后24、36、48、60、72h收集拯救病毒粒子。用此拯救病毒和母本病毒分別感染BHK-21細(xì)胞，測(cè)定各時(shí)段病毒的TCID50,并繪制病毒的生長(zhǎng)曲線。生長(zhǎng)曲線表明在轉(zhuǎn)染60h后病毒復(fù)制量達(dá)到頂峰，且拯救病毒與母本病毒的生長(zhǎng)曲線特征相似。
　　 為了研究拯救病毒的感染性，將30只1日齡的健康小鴨子分成三個(gè)組。其中1組和2組分別皮下注射0.