不同處理對(duì)半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞有效成分以及相關(guān)酶活性的影響.pdf

1、半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.是天南星科多年生草本植物，以塊莖入藥，是傳統(tǒng)的中藥材，為廣布物種，在我國(guó)很多地區(qū)均有種植。半夏含有多種化學(xué)成分，蛋白質(zhì)和生物堿為其藥理作用的主要成分之一。本試驗(yàn)通過組織培養(yǎng)的方法建立愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)體系，對(duì)半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行不同方式的處理，例如高溫脅迫、外源添加茉莉酸甲酯和水楊酸，研究不同方式處理對(duì)半夏懸浮細(xì)胞中總蛋白質(zhì)、總生物堿等有效成分及相關(guān)酶活性的影響。主要研究

2、結(jié)果如下：
　　1.取生長(zhǎng)旺盛，葉柄粗壯的無菌半夏試管苗，將其葉柄剪成小段(1-1.5cm)置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（MS+2.0mgL-1 6-BA+2.0mgL-1 2,4-D+2.0mgL-1 KT+6.5gL-1瓊脂+30gL-1蔗糖，pH6.0），培養(yǎng)20d左右可誘導(dǎo)出大量愈傷組織。
　　2.將愈傷組織繼代培養(yǎng)3-5次，挑取疏松的、生長(zhǎng)旺盛的半夏愈傷組織，將其置于液體懸浮培養(yǎng)基中(MS+0.5mgL-1 6-BA+1.0m

3、gL-1 2,4-D+300mgL-1 CH+30gL-1蔗糖，pH6.0)培養(yǎng)，建立穩(wěn)定的半夏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系。將其經(jīng)低溫同步化（8℃低溫條件下，處理24h，25℃恢復(fù)36h）后，轉(zhuǎn)入搖床培養(yǎng)。
　　3.當(dāng)半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(9d)，將其分成兩組，對(duì)照組正常培養(yǎng)，試驗(yàn)組35℃高溫脅迫培養(yǎng)，每隔5 d取材測(cè)總蛋白和生物堿含量。分別采用酸性染料比色法和Tris-HCl緩沖液提取法測(cè)量半夏細(xì)胞中總生物堿和蛋白含量。研究發(fā)

4、現(xiàn)試驗(yàn)組半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的干重和總蛋白的含量均明顯低于對(duì)照組，說明高溫對(duì)半夏懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)及懸浮細(xì)胞中總蛋白的含量均具有抑制作用。在35℃高溫培養(yǎng)的20d中，試驗(yàn)組生物堿含量大多高于對(duì)照組，說明在一定程度范圍內(nèi)，高溫處理對(duì)半夏懸浮細(xì)胞中生物堿的含量具有相對(duì)的促進(jìn)作用，且高溫脅迫5d時(shí)生物堿含量達(dá)到最大值，為139.42μg0.1g-1(干粉)。
　　4.同上面方法一樣，當(dāng)半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期（9d）分成兩組，對(duì)照組正常培養(yǎng)

5、，同時(shí)試驗(yàn)組分別外源添加50μmolL-1、100μmolL-1、150μmolL-1、200μmolL-1的MeJA，研究發(fā)現(xiàn)外源MeJA對(duì)半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞總生物量的積累存在一定的抑制作用，此外，對(duì)其生長(zhǎng)代謝周期還有相應(yīng)的延緩作用。試驗(yàn)組的半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，外源添加MeJA濃度為150μmolL-1、處理時(shí)間為15 d時(shí)生物堿和總蛋白含量均達(dá)到最高值。
　　5.在半夏懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，分別添加50μmolL-1，100μmo

6、lL-1，150μmolL-1，200μmolL-1 SA至試驗(yàn)組的半夏懸浮細(xì)胞中，每隔5d，取半夏懸浮細(xì)胞材料，分別測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)組干重、總蛋白及總生物堿含量。研究發(fā)現(xiàn)添加SA的試驗(yàn)組，濃度為150μmolL-1、處理15d時(shí)總蛋白含量最高，但是生物堿含量達(dá)到最高的組合為50μmolL-1 SA、處理15d。
　　6.同時(shí)對(duì)上述添加外源MeJA和SA的半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的相關(guān)酶的活性進(jìn)行測(cè)定，研究發(fā)現(xiàn)IMP脫氫酶和sAMP合成酶