GnRH1基因在雞卵巢卵泡中的表達(dá)及調(diào)控作用分析.pdf

1、雞的卵巢卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中，下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPGA）起到了非常重要的作用。下丘腦-垂體-性腺軸是一個(gè)完整而協(xié)調(diào)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，下丘腦通過分泌GnRH調(diào)節(jié)垂體LH和FSH的釋放，從而控制性腺發(fā)育和性激素的分泌。本研究對(duì)GnRH1在雞下丘腦和卵巢卵泡發(fā)育過程中的表達(dá)及其調(diào)控作用進(jìn)行了初步分析。結(jié)果如下：
　　1．qRT-PCR分析GnRH1基因在30、6

2、0、90、110和140日齡產(chǎn)蛋（140a）和未產(chǎn)蛋（140b）濟(jì)寧百日雞下丘腦和卵巢中的表達(dá)。結(jié)果顯示：GnRH1 mRNA在下丘腦和卵巢中的表達(dá)從30日齡至140日齡未開產(chǎn)雞均呈現(xiàn)出低高低高的趨勢(shì)，60日齡與140日齡的表達(dá)量顯著高于其他各個(gè)時(shí)期（P＜0.05），但兩者之間差異不顯著（P＞0.05）；而在卵巢中，140日齡時(shí)GnRH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量同下丘腦一樣顯著上調(diào)，但產(chǎn)蛋時(shí)卻顯著下調(diào)（P＜0.05），表現(xiàn)出與下丘腦不同的變

3、化趨勢(shì)。在開產(chǎn)后雞的不同等級(jí)卵泡中，GnRH1 mRNA表達(dá)從SW（the small white follicle）到F5（the fifth large follicle）最后到F1（the first large follicle）和POF1（the first post-ovulatory follicle）中的表達(dá)差異未達(dá)到顯著（P＞0.05）。
　　2．免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，GnRH1免疫陽性信號(hào)在未開產(chǎn)雞（45d）和

4、開產(chǎn)雞（159d）卵巢膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞均被檢測(cè)到，并且在未性成熟雞的卵巢中，其主要在卵泡顆粒細(xì)胞層表達(dá)較高，而性成熟后則在膜細(xì)胞層表達(dá)較高。進(jìn)一步分離性成熟卵巢卵泡的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞，qRT-PCR結(jié)果表明，GnRH1 mRNA在卵泡膜細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于顆粒細(xì)胞（P＜0.05），與免疫組化結(jié)果一致。
　　3.構(gòu)建GnRH1基因的過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染雞原代膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞后，檢測(cè)LHR，F(xiàn)SHR，PGR，ERα基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，

5、過表達(dá)GnRH1后，在顆粒細(xì)胞中，四個(gè)受體基因表達(dá)量均未出現(xiàn)顯著變化；在膜細(xì)胞中，F(xiàn)SHR，PGR，ERαmRNA表達(dá)量未發(fā)生顯著變化，而LHR mRNA表達(dá)量出現(xiàn)了顯著下調(diào)（P＜0.01）。隨后用LH和FSH激素處理膜細(xì)胞，檢測(cè)GnRH1 mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，F(xiàn)SH激素對(duì)GnRH1的表達(dá)無顯著影響，LH在濃度50 ng/mL時(shí)，GnRH1表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05）；繼續(xù)加大LH的濃度發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LH濃度大于200 ng/mL

6、時(shí)，GnRH1 mRNA表達(dá)量開始下調(diào)，而LHR mRNA表達(dá)量與LH濃度呈正相關(guān)。隨后用50 ng/mL LH激素與GnRH1過表達(dá)共處理后，LHR表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.01）。
　　4.在雞等級(jí)卵泡膜細(xì)胞中過表達(dá)GnRH1基因并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以未過表達(dá)GnRH1基因的膜細(xì)胞為對(duì)照，在過表達(dá)GnRH1的等級(jí)卵泡膜細(xì)胞中共篩選出了3997個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的差異表達(dá)基因1998個(gè)，下調(diào)的差異表達(dá)基因1999個(gè)，并對(duì)部

7、分差異表達(dá)基因進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，包括表達(dá)量下調(diào)的基因CYP11A1，MMP11，MMP13， StAR，上調(diào)的基因FOXP1，F(xiàn)OXP2，VEGFA，USF1。對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋發(fā)現(xiàn)，它們被富集到FOXO、MAPK、TGF-beta、VEGF、GnRH、PPAR、Prosgesterone-mediated oocyte maturation、Toll-like receptor以及Wnt等信號(hào)通路。
　　5.分析了G

8、nRH1基因5′調(diào)控區(qū)長(zhǎng)度3863bp片段的啟動(dòng)活性，雙熒光素酶活性分析結(jié)果表明，在GnRH1基因啟動(dòng)子區(qū)3863bp長(zhǎng)度內(nèi)各個(gè)區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)雙熒光素活性，具體原因需進(jìn)一步試驗(yàn)分析。
　　總之，我們目前的研究結(jié)果表明：GnRH1作為卵巢內(nèi)調(diào)節(jié)因子，接近開產(chǎn)時(shí)GnRH1 mRNA的高表達(dá)有助于雞性成熟的啟動(dòng)。在雞卵巢膜細(xì)胞中，GnRH1可介導(dǎo)LH與LHR受體的結(jié)合，從而影響卵巢卵泡的發(fā)育和排卵。GnRH1可與多種因子協(xié)同調(diào)控雞卵巢功能