卵巢早衰的相關(guān)因素分析及WT1、DMC1基因在卵巢早衰發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、本文從以下幾個(gè)方面展開論述：
　　第一部分 中國(guó)漢族卵巢早衰相關(guān)因素分析
　　卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是以女性40歲以前原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)，不孕，促性腺激素升高(FSH＞40IU/L)、雌激素降低及生殖器官萎縮等圍絕經(jīng)期表現(xiàn)為特征的內(nèi)分泌疾病。女性過早閉經(jīng)（＜40歲）可導(dǎo)致卵巢激素水平急劇下降并出現(xiàn)嚴(yán)重的圍絕經(jīng)期癥狀，患者的生理、心理均受到嚴(yán)重的影響。目前已明確部分POF病因，包

2、括基因和染色體異常、自身免疫性因素、病毒感染、環(huán)境和醫(yī)源性因素（如盆腔手術(shù)和放、化療病史）等，但大部分POF患者病因仍不清楚。POF病因的復(fù)雜性和異質(zhì)性增加了早期診斷和預(yù)防的難度。POF確診時(shí)卵巢功能多已發(fā)生不可逆性損傷，因而如何早期預(yù)測(cè)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及早做出診斷尤為重要。
　　目的:
　　本研究選取大樣本中國(guó)漢族POF患者進(jìn)行問卷調(diào)查，從社會(huì)學(xué)特征、既往病史、環(huán)境因素及生活習(xí)慣四個(gè)方面探討POF發(fā)病的相關(guān)因素，以期發(fā)現(xiàn)POF的危

3、險(xiǎn)因素，預(yù)測(cè)POF的高危人群，做到早預(yù)防、早診斷和早治療。
　　方法:
　　募集2008年～2013年就診于山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院的553例POF患者和400例對(duì)照組女性，對(duì)其進(jìn)行一對(duì)一專人問卷調(diào)查。對(duì)參與者的社會(huì)學(xué)特征、月經(jīng)史、生育史、既往病史、環(huán)境因素和生活習(xí)慣等進(jìn)行單因素和多因素Logistic回歸分析，計(jì)算OR值(odds ratios，OR)、95％可信區(qū)間(95％confidence intervals，95％CI

4、)和P值。
　　結(jié)果:
　　553例POF患者中，65例(65/544，11.95％)為原發(fā)性閉經(jīng)，479例(479/544，88.05％)為繼發(fā)性閉經(jīng)?；旧鐣?huì)學(xué)特征（職業(yè)、學(xué)歷等）未發(fā)現(xiàn)與POF的發(fā)病有相關(guān)性（P＞0.05）。環(huán)境因素方面，居住和/或工作環(huán)境裝修、經(jīng)常接觸農(nóng)藥和化學(xué)試劑等有毒物質(zhì)的女性更易患POF，較對(duì)照組具有顯著性差異(OR=4.76[2.98-7.61];OR=11.56[5.51-24.25]; O

5、R=4.47[2.09-9.58])。對(duì)既往病史進(jìn)行單因素Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)，流行性腮腺炎病史、陽性家族史和盆腔手術(shù)史，包括卵巢囊腫剝除術(shù)（子宮內(nèi)膜異位囊腫、漿液性囊腫和畸胎瘤）、一側(cè)卵巢切除術(shù)和輸卵管異位妊娠手術(shù)（輸卵管開窗術(shù)、輸卵管端端吻合術(shù)和輸卵管切除術(shù)）可顯著增加POF的患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=3.26[2.38-4.47];OR=28.12[8.84-89.46]; OR=5.53[2.15-14.23])。日常生活中經(jīng)常

6、飲茶、喜好素食和飲用礦物質(zhì)水的女性患POF的風(fēng)險(xiǎn)較低(OR=0.04[0.03-0.07]; OR=0.27[0.19-0.37]; OR=0.63[0.47-0.85])。
　　結(jié)論:
　　遺傳因素、盆腔手術(shù)史、流行性腮腺炎病史和有毒物質(zhì)接觸史為POF的危險(xiǎn)因素，而多食用素食、飲用礦物質(zhì)水和茶葉為保護(hù)性因素。我們建議有POF易感風(fēng)險(xiǎn)的女性及早進(jìn)行遺傳咨詢，遠(yuǎn)離可引起內(nèi)分泌紊亂的危險(xiǎn)因素，適量進(jìn)食富含類黃酮的食物，如水果、蔬

7、菜和茶葉等。
　　第二部分 腫瘤抑制因子WT1基因變異在卵巢早衰發(fā)病機(jī)制中的作用研究
　　目的:
　　本研究通過對(duì)384例中國(guó)漢族POF患者的WT1基因編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)基因變異，并就新發(fā)變異進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和體外功能實(shí)驗(yàn)，以探討WT1基因變異在POF發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:
　　共納入2003年4月～2011年12月于山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院就診的384例中國(guó)漢族POF患者為研究對(duì)象，募集查體中心卵巢

8、功能正常的384例健康女性作為對(duì)照。采用直接測(cè)序技術(shù)對(duì)WT1基因編碼區(qū)進(jìn)行突變篩查，應(yīng)用在線軟件Mutation Taster、Polyphen-2和SIFT對(duì)新發(fā)錯(cuò)義突變進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。通過序列比對(duì)，在小鼠野生型Wt1表達(dá)載體上進(jìn)行定點(diǎn)誘變，將野生型和突變型Wt1表達(dá)載體均進(jìn)行腺病毒包裝、擴(kuò)增和純化。野生型和突變型Wt1腺病毒分組感染3周齡小鼠的黃素化顆粒細(xì)胞，使Wt1基因過表達(dá)，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Wt1下游基因Amh、Fshr、L

9、hr、Cyp19、Cdh1和Par6b的表達(dá)量，以明確WT1基因新發(fā)突變對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的影響。
　　結(jié)果:
　　通過對(duì)384例POF患者WT1基因編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)新發(fā)突變和10個(gè)已知單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（single nucleotide polymorphisms，SNPs）。新發(fā)突變包括2個(gè)錯(cuò)義突變（位于第1外顯子的c.376C＞T，p.Pro126Ser和位于第7外顯子的c.1109G＞A,p.Arg370Hi

10、s）和4個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)的突變（分別為位于第1內(nèi)含子的c.647-26C＞T，c.647-13G＞C，c.647-13G＞A和位于第4內(nèi)含子的c.950+14T＞C)。10個(gè)已知SNPs有8個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)(rs2234585、rs1799933、 rs5030170、 rs5030171、 rs2295081、 rs5030277、 rs192734605和rs1799937)，2個(gè)位于編碼區(qū)但沒有改變編碼氨基酸(c.330T＞C，rs1

11、799925和c.1107G＞A，rs16754)。通過功能預(yù)測(cè)提示p.Pro126Ser和p.Arg370His可能影響蛋白功能，具有致病性。進(jìn)一步體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wt1基因上調(diào)下游基因Amh、Cdh1和Par6b的表達(dá)，而下調(diào)Fshr、Lhr和Cyp19基因的表達(dá)。錯(cuò)義突變p.Pro126Ser和p.Arg370His均可抑制下游基因Amh和Cdh1的表達(dá)，促進(jìn)Fshr和Cyp19的表達(dá)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　

12、　受WT1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游基因AMH，F(xiàn)SHR和CYP19參與顆粒細(xì)胞分化，CDH1影響卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞相互作用。在中國(guó)漢族POF患者中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)新發(fā)錯(cuò)義突變p.Pro126Ser和p.Arg370His均影響WT1對(duì)以上基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞分化和卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞相互作用障礙，繼而引起卵泡的過早耗竭。推測(cè)WT1可能是POF的潛在致病基因。
　　第三部分 減數(shù)分裂重組因子DMC1基因與卵巢早衰發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究<

13、br>　　背景:
　　目的:
　　本研究對(duì)192例中國(guó)漢族POF患者進(jìn)行基因測(cè)序分析，探討DMC1基因與POF發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。
　　方法:
　　共納入192例就診于山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院的中國(guó)漢族POF患者。采用直接測(cè)序技術(shù)對(duì)DMC1基因外顯子區(qū)進(jìn)行基因突變篩查。將單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（single nucleotide polymorphisms，SNPs）的基因型頻率和等位基因頻率同國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃數(shù)據(jù)

14、庫公布的亞洲正常人群數(shù)據(jù)相比較，研究SNPs與中國(guó)漢族POF發(fā)病的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　共發(fā)現(xiàn)2個(gè)已知SNPs，分別是位于第4內(nèi)含子的rs11570392和位于第10內(nèi)含子的rs4987164。這兩個(gè)SNPs的基因型和等位基因頻率在中國(guó)漢族POF患者和亞洲正常人群中均無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　在中國(guó)漢族POF人群中，DMC1基因編碼區(qū)變異并不常見。DMC1基因與POF發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性有待

15、在大樣本不同種族的POF患者中做進(jìn)一步研究。
　　第四部分 脫氫表雄酮改善卵巢反應(yīng)不良患者輔助生殖周期中的卵巢反應(yīng)性及妊娠結(jié)局
　　目的:
　　探討DHEA對(duì)中國(guó)漢族POR患者在ART周期中的卵巢反應(yīng)性及妊娠結(jié)局的影響。
　　方法:
　　回顧性分析2012年1月～2014年12月在山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院接受體外受精-移植(in vitro fertilization and embryo transfer，I

16、VF-ET)和胞漿內(nèi)單精子注射-移植（intra cytoplasmic sperm injection and embryo transfer，ICIS-ET）的POR患者170例?；颊叻肈HEA25mg，bid，服藥2-4個(gè)月后再次IVF/ICSI-ET助孕，前后兩周期給予同一控制性超促排卵方案，對(duì)患者ART周期中卵巢反應(yīng)性相關(guān)指標(biāo)和妊娠結(jié)局進(jìn)行自身對(duì)照研究。采用配對(duì)t檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)對(duì)患者服藥前后卵巢基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(an

17、tral follicle count，AFC)、HCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)（直徑＞14mm）、血清E2、P和LH水平、獲卵數(shù)、2PN數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、妊娠率及流產(chǎn)率進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:
　　170例患者平均年齡36歲，其中原發(fā)性不孕85例，繼發(fā)性不孕85例，睪酮均＜25ng/dl。服用DHEA后HCG日14mm以上卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、2PN卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚數(shù)[5.59±4.09，6.42±5.33，3(1-5)，1(0-3)]較服藥前[4

18、.87±3.15，5.74±4.29，2(1-4)，0(0-2)]均有顯著改善，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)治療后臨床妊娠率[29(17.06％)]顯著高于治療前[1(0.59％)]，生化妊娠流產(chǎn)率[6(3.53％)]顯著低于治療前[12(7.06％)](P＜0.01)?；A(chǔ)竇卵泡數(shù)和HCG日血清E2、P和LH水平服用DHEA前后無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　DHEA預(yù)處理可以增加POR患