AIV-HA1與CTB的融合蛋白在蘇云金芽胞桿菌表面的表達(dá)及其生物活性分析.pdf

1、禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的禽流感疫病能給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)還威脅著人類(lèi)健康。疫苗免疫是控制禽流感的有效措施。傳統(tǒng)疫苗需要注射免疫，操作復(fù)雜，且不能常溫保存。利用S-層蛋白在芽孢桿菌表面展示病原體抗原的特性和芽胞的耐熱性，可以開(kāi)發(fā)出口服且具有熱穩(wěn)定性的疫苗。
　　 本研究室已利用S-層蛋白在蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)表面分別表達(dá)了多種禽類(lèi)病

2、原體抗原(劉梅等，2007；Liu et al.，2008a；Liu et al.，2008b)，其中，用表達(dá)禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)H5亞型血凝素HA1的重組菌株免疫雛雞后，雛雞產(chǎn)生了AIV-H5亞型的特異性抗體，但抗體效價(jià)(3.8(log2》與實(shí)際使用標(biāo)準(zhǔn)(4(log2))尚存在一定差距。故本研究在劉梅等(2007)的研究基礎(chǔ)上，利用霍亂毒素B亞單位(Cholera toxin B subuI

3、ut，CTB)能提高黏膜免疫的特性，將CTB和HA1融合表達(dá)在Bt菌株BMB171表面，以期提高HA1免疫抗體效價(jià)，為研制耐熱口服禽流感疫苗打下基礎(chǔ)。
　　 1.血凝素基因hal和霍亂毒素基因ctb的克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建
　　 PCR擴(kuò)增目的基因hal和ctb，同時(shí)在保證氨基酸序列不變的基礎(chǔ)上對(duì)目的基因的EcoRⅠ和HincⅡ限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變。通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)獲得兩種融合基因ctb-hal和ctb-linke

4、r-hal。
　　 在表達(dá)載體pBMB982-304中S-層蛋白基因ctc的HincⅡ/XbaⅠ和EcoRI酶切位點(diǎn)處，分別插入目的基因和操縱子csaAB，得到重組質(zhì)粒pCSCH(csa-ctc-ctb-hal)、pCSCLH(csa-ctc-ctb-linker-hal)和對(duì)照質(zhì)粒pCSCTB(csa-ctc-ctb)、pCSHA1(csa-ctc-hal)。
　　 2.含融合基因的重組菌株的構(gòu)建及HA1的表達(dá)情況

5、r>　　 用電脈沖法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入蘇云金芽胞桿菌BMB171中，得到重組菌株MICTB(含pCSCTB)、MIHA1(含pCSHAl)、MICH(含pCSCH)和MICLH(含pCSCLH)。用血凝和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)上述4種重組菌株血凝素HA1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MIHA1、MICH和MICLH均有血凝活性，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清能夠抑制重組菌株的血凝能力，表明HA1蛋白在BMB171表面得到表達(dá)且具有活性。
　　 3.重組菌株的遺傳

6、穩(wěn)定性
　　 重組菌株MICH和MICLH在無(wú)抗性LB培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)50代，每間隔10代用Erm抗性LB平板檢測(cè)質(zhì)粒穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，MICH培養(yǎng)50代后質(zhì)粒穩(wěn)定性為80%；MICLH培養(yǎng)30代后穩(wěn)定性為86%，50代后質(zhì)?；締适А?br>　　 4.重組菌株對(duì)雛雞的免疫原性
　　 MICH和MICLH培養(yǎng)至穩(wěn)定期離心收集菌體，用1×109CFU菌液口服免疫艾維因肉雛雞3次，檢測(cè)血清IgG-HA1和黏膜SIgA-HA

7、1抗體水平，直接ELISA檢測(cè)黏膜總IgA效價(jià)。ELISA和HI結(jié)果顯示，免疫重組菌株MICH的雛雞血清，一免后HA1特異性抗體水平上升，之后抗體水平逐漸下降；而免疫重組菌株MICLH免疫的雛雞，其IgG抗體水平升高不顯著。洗液SIgA-HA1檢測(cè)結(jié)果顯示，MICH氣管黏膜IgA雖與對(duì)照組差異顯著，但ELISA最高值也僅為0.113(OD450)?？侷gA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MICH試驗(yàn)組能夠誘導(dǎo)鼻腔、氣管和腸道黏膜產(chǎn)生高水平的總IgA，但只有鼻