柿單寧基于AMPK和miRNA調(diào)節(jié)非酒精性脂肪肝和前脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制.pdf

1、本文旨在研究柿單寧對(duì)非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和前脂肪細(xì)胞分化的影響，確認(rèn)柿單寧是否是柿及其提取物降脂的主體成分，并探討柿單寧調(diào)控脂質(zhì)代謝的機(jī)制。本文以高膽固醇飼料誘導(dǎo)大鼠肝臟脂肪積累，并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，初步研究了柿單寧降脂及對(duì)肝臟脂肪聚集的影響，隨后以高脂飼料（豬油+膽固醇）構(gòu)建大鼠NAFLD模型，證實(shí)柿單寧是柿果改善NAFLD的主要功效成分，并采用動(dòng)物模型及細(xì)胞體系（人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞及前脂肪細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞），結(jié)合re

2、altimeRT-PCR和westernblot等分析技術(shù)對(duì)柿單寧調(diào)節(jié)NAFLD脂質(zhì)代謝的信號(hào)通路進(jìn)行了研究，比較了柿單寧及其結(jié)構(gòu)特征單元對(duì)肝脂肪變性的影響及機(jī)制，探討柿單寧的構(gòu)效關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:
　　1.柿單寧體內(nèi)外降脂的作用
　　為了研究柿單寧的降脂作用，我們采用高膽固醇飼料誘導(dǎo)大鼠高血脂及脂肪肝，研究柿單寧對(duì)血脂、肝脂的影響，并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，研究了柿單寧對(duì)胰脂酶和膽固醇酯酶活性的影響以及柿單寧與膽固醇膠束化、膽

3、汁酸的結(jié)合能力。結(jié)果表明，柿單寧能顯著降低大鼠血清和肝臟中甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量;肝組織形態(tài)學(xué)顯示柿單寧能降低肝臟脂肪的聚集，此外柿單寧還能增加血清中卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的活性，促進(jìn)糞便中膽酸的排泄。同時(shí)，我們也檢測(cè)了抗氧化能力的相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果表明柿單寧能減輕高膽固醇飼料誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化，增強(qiáng)血清中抗氧化酶的活力。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，

4、柿單寧能抑制胰脂酶（IC50為0.445mg/mL）和膽固醇酯酶（IC50為0.442mg/mL）的活性，柿單寧對(duì)胰脂酶的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制;柿單寧可降低膽固醇膠束化的溶解性，且與膽酸和脫氧膽酸具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，能降低腸道對(duì)脂質(zhì)和膽汁酸的吸收。這些結(jié)果表明柿單寧可能是柿及其提取物降脂的主體成分。
　　2.柿單寧是柿果基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途徑改善NAFLD的主體成分
　　采用高脂(HF，38％的能量來(lái)自脂肪

5、)飼料誘導(dǎo)大鼠NAFLD的形成，同時(shí)給予或不給予0.5％的柿單寧，4.2％的柿果凍干粉（含有相同量的柿單寧），研究柿單寧和柿果對(duì)NAFLD的影響及機(jī)理。實(shí)驗(yàn)9周后，我們發(fā)現(xiàn)，柿單寧和柿果均能顯著降低(P＜0.05)大鼠血清TG和游離脂肪酸含量，升高HDL-C水平;增加糞便中TG、TC和膽汁酸的排泄，改善肝脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。RealtimeRT-PCR結(jié)果表明，柿單寧和柿果還能顯著(P＜0.05)下調(diào)脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)，如固醇調(diào)

6、節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)、乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)和硬脂酰輔酶A脫氫酶1(SCD1);上調(diào)脂肪氧化相關(guān)基因的表達(dá)，如肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)。Westernblot結(jié)果顯示，在柿單寧和柿果的作用下，肝臟中AMPK被顯著(P＜0.05)激活。此外，柿單寧和柿果還能顯著降低(P＜0.05)肝臟中炎癥因子的含量和核因子κB(NFκB)的蛋白表達(dá)。提示柿單寧是柿果改善高脂誘導(dǎo)的肝脂肪變性和慢性炎癥反應(yīng)的主體成分，其作用機(jī)理

7、與激活A(yù)MPK信號(hào)通路有關(guān)。
　　3.柿單寧基于miR-122和miR-33b調(diào)節(jié)人正常肝細(xì)胞L02單純性脂肪積累
　　我們以0.4mmol/L的油酸誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞L02單純性脂肪變性模型，研究柿單寧及其主要特征單元對(duì)脂質(zhì)代謝的機(jī)制，結(jié)果表明，柿單寧及其主要特征單元能降低細(xì)胞內(nèi)TG的積累，其中A型連接ECG二聚體、A型連接EGCG二聚體作用最強(qiáng)，與柿單寧作用相當(dāng)，而A型連接EC二聚體和B型連接二聚體作用較弱。柿單寧及其主要

8、特征單元降低L02細(xì)胞脂肪合成相關(guān)基因SREBP1C和脂肪酸合成酶(FAS)的表達(dá)，但并不增加脂肪酸氧化基因CPT1的表達(dá)和AMPK的磷酸化，提示其抑制L02細(xì)胞脂肪的積累不是通過(guò)AMPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。并且柿單寧及其主要特征單元可抑制人肝細(xì)胞L02中miR-122和miR-33b以及下游脂肪合成相關(guān)基因SREBP1C和FAS的表達(dá)。柿單寧對(duì)以上基因表達(dá)的抑制從3h開(kāi)始，而二聚體在0.5h時(shí)即可表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用。柿單寧通過(guò)miR-1

9、22和miR-33b抑制油酸誘導(dǎo)的L02肝細(xì)胞脂肪變性，這種作用主要?dú)w功于結(jié)構(gòu)中ECG和EGCG單元以及黃烷醇的A型連接方式。
　　4.柿單寧基于miR-27a/b抑制前脂肪細(xì)胞3T3-L1的分化
　　柿單寧濃度為60μg/mL時(shí)對(duì)前脂肪細(xì)胞3T3-L1成脂分化的抑制率達(dá)到了68.6％，這種作用主要發(fā)生在細(xì)胞分化早期階段，阻礙細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。柿單寧可降低前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶增值激活受體γ（PPARγ）、CC

10、AAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)和SREBP1C的表達(dá)，降低其下游基因FAS、ACC1等的表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。柿單寧可上調(diào)前脂肪細(xì)胞3T3-L1中miR-27a和miR-27b的表達(dá)，其靶基因PPARγ的蛋白表達(dá)也受到抑制。總之，柿單寧可通過(guò)調(diào)控miR-27a/b-PPARγ信號(hào)通路抑制前脂肪細(xì)胞的分化，減少細(xì)胞內(nèi)脂肪的積累。
　　5.柿單寧主要特征單元基于miR-27a/b抑制前脂肪細(xì)胞3T3-L1的分化
　　柿

11、單寧中含量最為豐富的兩種特征單元（A型連接ECG二聚體和EGCG二聚體）具有很好的抑制前脂肪細(xì)胞3T3-L1成脂分化的效果，這種抑制作用主要發(fā)生在細(xì)胞分化早期階段，阻礙有絲分裂克隆擴(kuò)增(MCE)進(jìn)程。A型連接EC二聚體也能在一定程度上抑制前脂肪細(xì)胞的成脂分化，但效果不如前兩種，B型連接EC二聚體無(wú)此作用。A型連接ECG二聚體和EGCG二聚體可通過(guò)上調(diào)前脂肪細(xì)胞3T3-L1中miR-27a和miR-27b的表達(dá)，進(jìn)而抑制其靶基因PPARγ