蜜蜂螺原體的侵染循環(huán)及其在蜜蜂體內(nèi)的定殖研究.pdf

1、蜜蜂螺原體是一種螺旋狀、能運(yùn)動(dòng)、無細(xì)胞壁的原核生物，主要寄生在青壯年蜂的體內(nèi)，是引起我國蜜蜂“爬蜂病”的主要病原之一。20世紀(jì)80年代以來，蜜蜂螺原體病在我國各地養(yǎng)蜂區(qū)普遍蔓延，且常與孢子蟲病、麻痹病等混合發(fā)生，給養(yǎng)蜂業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，在蜜蜂螺原體病發(fā)病時(shí)期，蜜蜂、植物花及其它一些膜翅目、雙翅目、鱗翅目昆蟲內(nèi)均能檢測到螺原體，在養(yǎng)蜂地區(qū)的非發(fā)病時(shí)期，尤其是冬季和炎熱的夏季卻均未能檢測到。根據(jù)研究結(jié)果，學(xué)者們推測出蜜蜂螺原體

2、在自然界的一些可能的侵染循環(huán)途徑，但一直缺乏系統(tǒng)的研究和直接的證據(jù)。本研究針對(duì)引起我國蜜蜂“爬蜂病”的螺原體Spiroplasma melliferum，建立了一種分子生物學(xué)快速檢測方法，系統(tǒng)地對(duì)其宿主范圍、可能的傳播途徑進(jìn)行了研究，并對(duì)分離自同一時(shí)期不同宿主中螺原體的基本生物學(xué)特性及致病性進(jìn)行了比較。初步研究了S.melliferum在蜜蜂中腸和胸肌內(nèi)的定殖與侵染特征。
　　 針對(duì)引起我國蜜蜂螺原體病的病原菌S.mellife

3、rum，通過對(duì)Chelex-100 DNA提取技術(shù)的改進(jìn)，建立了一種分子生物學(xué)快速檢測方法。該方法可以在2～4小時(shí)內(nèi)檢測出植物花、蜜蜂及其生活環(huán)境中是否含有螺原體，最低檢測濃度為5～6個(gè)/mL。與常規(guī)分離培養(yǎng)法比較，該方法具有靈敏、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，這為蜜蜂螺原體病的快速診斷及螺原體資源調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了探索蜜蜂螺原體在自然界中可能的傳播途徑及其侵染循環(huán)，本研究采用分子生物學(xué)快速檢測方法和分離培養(yǎng)技術(shù)定期對(duì)蜜蜂及自然界

4、中蜜蜂經(jīng)?；顒?dòng)的場所中的材料、植物花及其它一些相關(guān)昆蟲進(jìn)行檢測。從2010年3月到2012年1月，共采集了1339只意蜂(Apis mellifera)、131種昆蟲、51種植物花和77個(gè)從蜂箱內(nèi)采集的樣本，并在其中92個(gè)樣本中檢測到螺原體，分離獲得54株螺原體菌株。在一年四季(包括蜜蜂螺原體病發(fā)病時(shí)期和非發(fā)病時(shí)期）采集的蜜蜂樣本中均檢測到螺原體，以在春季、發(fā)病時(shí)期病蜂體內(nèi)檢測到螺原體的幾率最高。此外，在發(fā)病時(shí)期采集的蜜蜂幼蟲、蛹、植物

5、花、其它昆蟲、蜂房、巢門、巢脾等樣本中，均檢測到螺原體，在非發(fā)病時(shí)期，則僅在少數(shù)蜜蜂體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。表明蜜蜂螺原體長期存在于蜜蜂體內(nèi)，可通過水平傳播方式進(jìn)行傳播。
　　 為進(jìn)一步證實(shí)蜜蜂螺原體可以通過水平傳播方式在蜜蜂和植物花間進(jìn)行傳播，本研究采用人工接種法分別接種螺原體到蜜蜂和植物花上，對(duì)其傳播途徑進(jìn)行了探索。結(jié)果顯示:體內(nèi)含菌的蜜蜂可以通過采食花蜜的方式將螺原體傳播到植物花表面，而花表的螺原體又可以通過蜜蜂的采食傳播到蜜蜂體內(nèi)以及

6、其它植物花的表面，傳播到蜜蜂體內(nèi)的致病性菌株可以引起蜜蜂“爬蜂病”的癥狀，而植物無任何病狀。該結(jié)果為研究蜜蜂螺原體在自然界的傳播途徑提供了直接的證據(jù)。
　　 通過對(duì)分離自同一時(shí)期相同地點(diǎn)不同宿主(患病蜜蜂、健康蜜蜂、死蜂、打碗花、楝樹花、一年蓬、蓼科植物花）中的7株分離菌株的形態(tài)學(xué)、運(yùn)動(dòng)性、基本生物學(xué)特性、血清學(xué)及分子生物學(xué)特性的研究及比較，發(fā)現(xiàn)7株菌的特性均符合Spiroplasma屬的描述。其中，分離菌株MF1006和LK1

7、001的生長速度最快，倍增時(shí)間分別為1.8 h和2.4 h;MF1008生長最慢，倍增時(shí)間為7.8h。菌株MF1006、YNP1001和LK1001在37℃均不能生長，最適溫度比其余4株菌略低。代謝抑制試驗(yàn)、菌體變形試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)的結(jié)果均一致表明:螺原體S.melliferum CH-1的抗血清對(duì)菌株MF1006、 YNP1001、LK1001幾乎沒有抑制作用，對(duì)其它4株菌的生長抑制作用卻較強(qiáng);ZHUF0901和MF0905的抗血

8、清則分別與MF1006、 YNP1001和LK1001發(fā)生較強(qiáng)的反應(yīng)。根據(jù)16SrDNA和ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示:MF1006、YNP1001與Spiroplasma apis聚為一類;LK1001與Spiroplasma clarkii聚為一類;其它4株菌則都與S.melliferum聚類。以上結(jié)果表明同一時(shí)期同一地區(qū)的蜜蜂和植物花樣本中所含的螺原體均不止一種;不同宿主中的螺原體均分別與S.apis和S.melliferum聚

9、類，進(jìn)一步證實(shí)螺原體在自然界中可通過水平傳播方式進(jìn)行傳播。
　　 綜上，提出了蜜蜂螺原體在自然界中的傳播途徑:(1)在蜜蜂螺原體病暴發(fā)時(shí)期(一般為春季4、5月），蜜蜂螺原體由含菌蜜蜂體內(nèi)傳播到蜂箱肉蜜蜂經(jīng)?；顒?dòng)的場所或蜂箱外界的植物花表面，健康蜜蜂或其它昆蟲在含菌的處所和植物花表面活動(dòng)后可將其攜帶或感染的螺原體傳播到蜂箱內(nèi)別處或其它的植物花表面，為其它蜜蜂和昆蟲的再次感染提供侵染原;(2)在非發(fā)病時(shí)期，蜂場幾乎沒有爬蜂，蜜蜂螺原

10、體檢測到的幾率也極低，推測此時(shí)螺原體不易穿過蜜蜂的中腸屏障到達(dá)淋巴組織大量繁殖而引起蜜蜂死亡，少量的螺原體在蜜蜂體內(nèi)可能會(huì)長期生存或經(jīng)消化道排泄在蜂箱內(nèi)或周圍后感染其它健康蜜蜂，當(dāng)天氣變化或其它因素致使蜜蜂抵抗力下降時(shí)，螺原體便可穿過蜜蜂中腸屏障導(dǎo)致蜜蜂的死亡，這可能也是在非發(fā)病季節(jié)蜂場也偶爾出現(xiàn)少量爬蜂的緣故。
　　 此外，通過飼喂新鮮菌液的方法對(duì)兩株與引起蜜蜂“五月病”的S.apis聚類的螺原體MF1006、YNP1001以

11、及一株與引起蜜蜂“螺原體死亡病”的S.melliferum聚類的螺原體MF1008的致病性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)感染供試螺原體菌株的意蜂(Apis mellifera）在第5d時(shí)均開始出現(xiàn)“爬蜂”癥狀，但在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，感染MF1006及YNP1001菌液的蜜蜂的發(fā)病速度較快。到第9d時(shí)，感染供試螺原體菌液的實(shí)驗(yàn)組意蜂的死亡率均明顯高于對(duì)照組的意蜂(飼喂新鮮培養(yǎng)基），與對(duì)照組意蜂相比差異均極顯著(1％水平）。從實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組死亡的蜜蜂中

12、均能分離到螺原體，在培養(yǎng)基對(duì)照組的死蜂內(nèi)則未能分出。通過對(duì)死蜂內(nèi)再分離物及飼喂的螺原體菌株的16S rDNA序列作比對(duì)，發(fā)現(xiàn)再分離菌株均與原菌株同源性最高，說明螺原體MF1006、MF1008、YNP1001確實(shí)是意蜂死亡的病因。菌株MF1006和YNP1001的發(fā)現(xiàn)豐富了對(duì)我國蜜蜂“爬蜂病”病原的認(rèn)識(shí)，這是在我國蜜蜂和植物花上首次發(fā)現(xiàn)的除S.melliferum以外的另一種對(duì)蜜蜂致病的螺原體。
　　 最后，利用分子生物學(xué)檢測方

13、法在患病蜜蜂的中腸、淋巴液和胸部肌肉中均檢測到螺原體，健康蜜蜂內(nèi)則沒有。應(yīng)用透射電子顯微鏡對(duì)S.melliferum CH-1在意蜂的中腸和胸部肌肉中的分布、侵染機(jī)制及由其引起的宿主細(xì)胞的病理變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)螺原體通常大量地聚集在膜包裹的細(xì)胞質(zhì)囊泡內(nèi)，分布于中腸上皮細(xì)胞頂端和內(nèi)部的核附近、基底面的質(zhì)膜與基板之間、基板內(nèi)部及胸部肌肉細(xì)胞內(nèi)。相對(duì)于健康蜜蜂肌肉細(xì)胞內(nèi)整齊排列的纖維束，被螺原體侵染的纖維束表現(xiàn)出明顯的斷裂、松散排列。這些癥狀