蜜蜂螺原體Spiroplasma melliferum CH-1細(xì)胞骨架相關(guān)基因的研究.pdf

1、螺原體屬于柔膜菌綱，不似其他細(xì)菌有細(xì)胞壁，但是它僅靠單層膜即能維持螺旋狀的特殊形態(tài)和運(yùn)動(dòng)形式，它是研究運(yùn)動(dòng)性的模式生物，研究它的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)對(duì)深入了解生物的基本規(guī)律有極其重要的意義。細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方式與其細(xì)胞骨架有關(guān)，fib基因是螺原體中特有的基因，其編碼的Fib蛋白是螺原體細(xì)胞骨架的主要組成部分。mreB基因是編碼細(xì)胞骨架蛋白的相關(guān)基因之一，其編碼的MreB蛋白有維持螺原體獨(dú)特的螺旋細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用。因此研究螺原體細(xì)胞骨架相關(guān)基因mre

2、B、fib有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)螺原體的形態(tài)變化和運(yùn)動(dòng)的機(jī)制。本研究在測(cè)定蜜蜂螺原體Spiroplasmamelliferum CH-1基因組序列的基礎(chǔ)上，應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析細(xì)胞骨架相關(guān)基因mreB和fib、研究mreB基因的外源表達(dá)情況，以及螺原體在非螺旋狀和螺旋狀時(shí)mreB、fib基因的表達(dá)差異，為今后深入研究MreB體外聚合作用，進(jìn)一步研究其在體內(nèi)的聚合特點(diǎn)，以及mreB、fib基因的功能分析奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果有:
　　第

3、一、螺原體CH-1中含有5個(gè)mreB基因、1個(gè)fib基因，利用生物信息學(xué)的方法，對(duì)mreB1-mreB5和fib所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明:(1) MreB1-MreB5的分子量分別為36、23、23、37、25 kD，其中MreB1的分子量與其他細(xì)菌（如Escherichia coli)中的分子量一致，均為36kD，預(yù)測(cè)Fib分子量為58 kD，與其他研究者所報(bào)道的大小相似;(2) MreB蛋白屬于MreB/Mbl蛋白質(zhì)家族，F(xiàn)

4、ib蛋白的N端（14-226的氨基酸位置）預(yù)測(cè)屬于磷酸化酶家族(Phosphorylase superfamily)，與Cohen-Krausz等的預(yù)測(cè)結(jié)果相似。(3)利用SWISS-MODEL自動(dòng)同源建模，預(yù)測(cè)了螺原體CH-1 MreB蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)MreB1、MreB4、MreB5的蛋白結(jié)構(gòu)相似，有細(xì)微的差異，MreB2和MreB3的蛋白結(jié)構(gòu)相近，存在較小差異。Fib由于是螺原體中獨(dú)特的蛋白，并不能根據(jù)同源建模的方法得到整

5、個(gè)蛋白的三維結(jié)構(gòu)。(4)S.melliferum CH-1的MreB氨基酸與其他細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，MreB1-MreB5分別與其他螺原體相對(duì)應(yīng)的MreB蛋白親緣關(guān)系較近。
　　第二、根據(jù)螺原體CH-1全基因組測(cè)序得到的細(xì)胞骨架相關(guān)基因mreB序列設(shè)計(jì)引物，首次克隆了螺原體的mreB1-mreB5基因，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(表達(dá)質(zhì)粒為pET-28a)表達(dá)純化了MreB蛋白。在蛋白純化時(shí)發(fā)現(xiàn)E coil所表達(dá)的螺原體CH-1Mre

6、B1-MreB5目的蛋白存在于包涵體之中，需用含8 mol/L尿素的Binding Buffer才能溶解，屬于疏水性蛋白質(zhì)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，推測(cè)表達(dá)的螺原體CH-1中的MreB蛋白可能都是疏水性蛋白，為今后研究MreB體外聚合作用以及進(jìn)一步研究其在體內(nèi)的聚合特點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　第三、螺原體CH-1在培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)有明顯的變化，用暗視野顯微鏡觀察在延滯前期絕大部分螺原體成小點(diǎn)狀，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期螺原體絕大多數(shù)呈螺旋狀，而在電鏡下觀察暗

7、視野顯微鏡下成小點(diǎn)狀的螺原體則呈各種不規(guī)則的近球形，或末端膨大的稍彎曲的桿狀。利用二步法的real-time PCR方法，以SYBR GreenⅠ染料法相對(duì)定量螺原體CH-1在螺旋狀和非螺旋狀時(shí)mreB1-mreB5、fib基因的表達(dá)，結(jié)果表明:(1)mreB1-mreB5和fib基因在非螺旋狀時(shí)的表達(dá)量相對(duì)于螺旋狀時(shí)表達(dá)量存在顯著差異。螺原體在典型的螺旋形時(shí)，mreB、fib基因的表達(dá)量比螺原體在非螺旋狀時(shí)表達(dá)量顯著提高，初步表明螺原

8、體CH-1維持螺旋形需要mreB和fib基因的參與，這些細(xì)胞骨架相關(guān)基因可能與螺原體的形態(tài)相關(guān);(2)螺原體從非螺旋狀生長(zhǎng)到螺旋狀期間，fib基因表達(dá)的增幅水平大于mreB基因表達(dá)的增幅水平。推測(cè)對(duì)于螺原體CH-1螺旋形態(tài)的維持fib基因可能比mreB基因作用明顯，所以mreB、fib基因的功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　本研究結(jié)果為今后進(jìn)一步確定這些基因在蜜蜂螺原體CH-1形態(tài)和運(yùn)動(dòng)性方面的作用提供了重要信息，為進(jìn)一步研究基因的功能奠