鮸魚(Miichthys miiuy)自然殺傷細胞增強因子基因克隆及表達分析.pdf

1、自然殺傷細胞增強因子(Natural killer enhancing factor, NKEF)于1993年在人類的紅細胞中被分離純化，成為了Peroxiredoxin(Prx)抗氧化蛋白家族一個重要的成員。因為在體外可以增強自然殺傷細胞對腫瘤細胞的細胞毒效應，所以被命名為自然殺傷細胞增強因子。為了研究硬骨魚中NKEF的免疫防御機制，在本篇論文中，我們采用快速擴增cDNA末端(rapid amplification of cDNA e

2、nds，RACE)的方法，經(jīng)過凝膠回收、連接、轉化、陽性克隆子的檢測和測序后，得到鮸魚NKEF-A全長cDNA序列。鮸魚NKEF-A cDNA全長為1235bp，其中包括47bp的5'非翻譯區(qū)，597bp的開放閱讀框和591bp的3'非翻譯區(qū)，整個開放閱讀框編碼198個氨基酸。鮸魚NKEF-A的蛋白分子量約為23kDa，在其蛋白質(zhì)序列中，含有三個半胱氨酸殘基(Cys)，其中第52位和173位上的半胱氨酸殘基分別存在于兩個高度保守的VCP

3、信號上，通過比對其他幾種I類抗氧化蛋白家族成員后，發(fā)現(xiàn)這兩個位置的半胱氨酸殘基也是非常保守的，并且是Prx家族蛋白發(fā)揮其生物學功能的氨基酸區(qū)域。熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析后表明，NKEF-A基因在鮸魚十個正常組織中普遍表達，但是表達水平有著明顯的差異。在不同時間段鰻弧菌感染的肝組織、脾組織和腎組織中，NKEF-A的表達水平均有所上調(diào)。最后，我們構建了重組表達載體pET-NKEF質(zhì)粒，誘導重組質(zhì)粒表達，確定最佳的誘導時間以及誘導濃度，純化了重