A-Califonia-07-2009亞型豬流感冷適應(yīng)減毒疫苗株的拯救及免疫效果評價(jià).pdf

1、甲型H1N1流感病毒是甲型(A型)流感病毒引起的嚴(yán)重威脅人類健康的一種急性、呼吸道傳染性疾病。疫苗和藥物是控制和治療該病的主要措施。但從長遠(yuǎn)看，疫苗仍是控制流感傳播的主要手段。
　　流感疫苗有滅活和減毒兩種，滅活流感疫苗據(jù)有較好的體液免疫效果，但細(xì)胞免疫、粘膜免疫效果較差。流感減毒活疫苗不但據(jù)有較好的體液免疫，而且細(xì)胞免疫及粘膜免疫效果也很好。近幾年研究表明，細(xì)胞免疫及粘膜免疫在預(yù)防流感病毒的傳播方面發(fā)揮著重要的作用，特別是激活機(jī)

2、體的細(xì)胞免疫，能夠增強(qiáng)疫苗對流感病毒的免疫保護(hù)效力。目前我國僅有滅活疫苗。因此，發(fā)展我國自主研制的流感減毒活疫苗就成為當(dāng)前急需解決的問題。
　　本研究應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)，以 A/Ann Arbor/6/60 ca(H2N2)型流感病毒做為骨架病毒，將其6個(gè)內(nèi)部基因(PB1、PB2、NP、NA、M、NS)及WHO推薦的H1N1疫苗株-A/California/07/2009流感病毒HA、NA基因分別構(gòu)建到雙向表達(dá)載體pAD3000上

3、，共轉(zhuǎn)染 MDCK～ COS1細(xì)胞，得到冷適應(yīng)、溫度敏感、減毒的A/California/07/2009ca(CA/AA ca)感病毒。通過基因鑒定、抗體中和試驗(yàn)、IFA及病毒在MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)等方法對重配病毒的生物學(xué)特性、型別、表型進(jìn)行了鑒定。通過雞胚培養(yǎng)建立了2級毒種庫，并應(yīng)用無菌試驗(yàn)、支原體檢測、外源因子檢測等方法證明重配病毒的毒種可以做為疫苗毒種應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，重配CA/AA ca流感病毒免疫的BALB/c小鼠及雪貂，應(yīng)用T

4、CID50、間接ELISA、MTT、HI等方法對CA/AA ca流感病毒進(jìn)行了體液免疫、細(xì)胞免疫及粘膜免疫應(yīng)答效果的評價(jià)以及對小鼠、雪貂的免疫保護(hù)效力的研究。
　　結(jié)果:
　　1.病毒的拯救及鑒定：構(gòu)建了 pAD3000-HA和 pAD3000-NA質(zhì)粒，并與 A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)型流感病毒的6個(gè)內(nèi)部骨架組成8質(zhì)粒，應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救出的CA/AA ca病毒，經(jīng)鑒定CA/AA ca病毒為A/C

5、alifornia/07/2009亞型，并且具有冷適應(yīng)性、溫度敏感的表型。
　　2.毒種庫的鑒定及病毒純化：建立了二級疫苗用CA/AA ca病毒種子庫，其血凝效價(jià)均為1：256，經(jīng)鑒定無細(xì)菌、支原體、外源因子污染。病毒接種時(shí)105倍稀釋、稀釋液為PBS、培養(yǎng)時(shí)間72h、培養(yǎng)溫度33℃，并用蔗糖密度梯度離心的方法初步純化了CA/AA ca流感病毒。
　　3.CA/AA ca流感病毒免疫應(yīng)答效果的研究：
　　（1）TPCK

6、胰酶依賴性的檢測應(yīng)用TCID50檢測BJ501病毒及CA/AA ca病毒的毒力，加入TPCK胰酶（0.8μg/mL）后，CA/AA ca流感病毒TCID50升高1.25，BJ501病毒 TCID50無顯著變化；經(jīng)蔗糖密度梯度離心方法純化流感病毒；純化后 CA/AA ca病毒 TCID50為9.3，BJ501病毒TCID50為7.5；CA/AA ca病毒滴度免疫免疫BALB/c，免疫的最佳劑量為1×106TCID50/20μL。
　

7、　（2）CA/AA ca病毒滴鼻免疫BALB/c小鼠，以A/California/07/2009流感滅活病毒肌肉注射為對照，A/California/07/2009流感滅活病毒HI效價(jià)顯著高于CA/AA ca病毒滴鼻組（p<0.05），而IgA顯著低于滴鼻組（p<0.01）；滅活病毒肌肉注射組的 IL-4水平顯著高于滴鼻組（p<0.05），而 IL-6水平兩者差異不顯著（p>0.05）；滅活病毒肌肉注射組IFN-γ水平顯著低于CA/AA

8、 ca病毒組（p<0.01）。
　　（3）CA/AA ca病毒免疫小鼠，鼻、肺中檢測到較低滴度的病毒滴度，4d后病毒消失。BJ501病毒在小鼠鼻、肺中檢測到高滴度病毒，免疫后9d全部死亡。CA/AA ca流感病毒二免2周應(yīng)用BJ501病毒攻毒，3d后鼻、肺、脾、腎、腦中未檢測到病毒。小鼠存活率100%。
　　（4）CA/AA ca病毒、BJ501病毒滴鼻免疫雪貂，CA/AA ca病毒組雪貂未發(fā)生明顯的生理變化，鼻腔3d后檢測

9、不到病毒的存在。BJ501病毒組出現(xiàn)感冒癥狀，并且1到7d鼻腔中均檢測到較高的病毒滴度。CA/AA ca病毒組免疫3d后在雪貂的鼻、肺、腦中未檢測到病毒的存在，BJ501病毒組在雪貂的鼻、肺、腦中檢測到較高病毒滴度。CA/AA ca病毒免疫雪貂后處死采集血清，血清中的抗體對CA/AA ca病毒及BJ501病毒均有很好的中和效果，二者無顯著性差異（p>0.05）, CA/AA ca病毒2免2周后免疫BJ501病毒，3d后在鼻、肺中僅檢測到

10、少量的病毒存在。
　　結(jié)論:
　　本試驗(yàn)成功拯救出的冷適應(yīng)、溫度敏感、減毒的CA/AA ca病毒。按照2010藥典的要求建立了主種子庫及工作種子庫，并確定了病毒的培養(yǎng)溫度、時(shí)間及接種濃度。應(yīng)用蔗糖密度梯度離心的方法初步純化了BJ501流感病毒及CA/AA ca流感病毒。
　　CA/AA ca流感病毒對小鼠無致病性，能夠刺激小鼠產(chǎn)生較好的體液免疫、細(xì)胞免疫及粘膜免疫應(yīng)答，并且CA/AA ca流感病毒對同亞型病毒具有較好的