二化螟抗藥性監(jiān)測及其解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、二化螟屬于鱗翅目螟蛾科，是水稻上重要的鉆鉆蛀性害蟲之一。二化螟在我國的危害范圍很廣，并且除了水稻外還可以危害茭白、甘蔗等多種作物。長期連續(xù)的使用殺蟲劑，必然會(huì)帶來抗藥性問題。水稻的水田生長環(huán)境和糧食作物的特性使得可以用于水稻害蟲防治的殺蟲劑種類有限，因此亟需高效合理的抗性治理措施以延緩現(xiàn)有殺蟲劑的使用壽命?？剐詸C(jī)理的深層分子機(jī)制研究可以為抗性治理措施的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。本文監(jiān)測了不同地區(qū)二化螟對(duì)幾種常見殺蟲劑的抗性，并對(duì)二化螟主要解毒代

2、謝酶基因進(jìn)行了克隆和分析，還通過誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究了二化螟解毒代謝酶基因?qū)Σ煌瑲⑾x劑的誘導(dǎo)響應(yīng)，相關(guān)研究結(jié)果可以為二化螟抗性治理措施的發(fā)展提供理論依據(jù)。
　　1.不同地區(qū)水稻二化螟抗藥性監(jiān)測
　　利用準(zhǔn)確可靠的方法監(jiān)測掌握害蟲田間抗藥性動(dòng)態(tài)，是害蟲抗藥性治理的關(guān)鍵。本研究首先利用室內(nèi)敏感品系和野外田間種群比較研究了2種螟蟲抗藥性測定方法，結(jié)果表明初孵幼蟲藥膜法方法使用簡便，監(jiān)測抗性靈敏度高，可用于二化螟的抗性監(jiān)測。其后利用初孵幼蟲

3、藥膜法測定了我國7個(gè)地理種群二化螟對(duì)氯蟲苯甲酰胺、丁烯氟蟲腈、三唑磷和丙溴磷的抗性水平，結(jié)果表明，我國多數(shù)稻區(qū)的二化螟對(duì)三唑磷和丙溴磷都產(chǎn)生了高水平抗性，僅有四川萬州等少數(shù)地區(qū)仍保持敏感水平;但對(duì)新藥氯蟲苯甲酰胺大都保持敏感，僅有浙江金華等極少數(shù)地區(qū)的二化螟敏感性下降，開始產(chǎn)生低水平抗性（9.4倍）;以室內(nèi)敏感品系雖然沒有檢測出丁烯氟蟲腈的抗性，但地區(qū)種群之間差異較大，表明局部地區(qū)可能因氟蟲腈的施藥歷史存在交互抗性。第三，利用廣西地區(qū)的

4、3種螟蟲比較了6種殺蟲劑對(duì)二化螟、大螟和臺(tái)灣稻螟的毒力差異，結(jié)果表明，僅有阿維菌素和殺蟲單等少數(shù)藥劑對(duì)不同螟蟲具有相似的毒力，其余大都表現(xiàn)出明顯的毒力差異:氯蟲苯甲酰胺對(duì)臺(tái)灣稻螟毒力相對(duì)較差;丁烯氟蟲腈對(duì)二化螟的毒力顯著大于大螟，而醚菊酯和三唑磷對(duì)大螟的毒力顯著高于二化螟，這三種藥劑對(duì)臺(tái)灣稻螟的毒力均位于二化螟和大螟之間。討論認(rèn)為目前防治水稻螟蟲應(yīng)該限制使用有機(jī)磷等已經(jīng)產(chǎn)生較高水平抗性的老農(nóng)藥品種，新藥使用首先應(yīng)注意抗藥性治理，延緩抗性

5、發(fā)展，尤其是高抗地區(qū)，其次是應(yīng)該針對(duì)當(dāng)?shù)氐拿x優(yōu)勢(shì)種選擇藥劑，進(jìn)行針對(duì)性藥劑防治。
　　2.二化螟P450基因的轉(zhuǎn)錄組分析
　　研究昆蟲全基因組CYP基因有利于弄清參與特定生理生化功能的P450基因，進(jìn)而可以開發(fā)新型害蟲防控技術(shù)，以及抗藥性精準(zhǔn)監(jiān)控技術(shù)。本研究利用轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行二化螟的全基因組CYP基因研究，共發(fā)現(xiàn)并命名72個(gè)二化螟CYP基因，并克隆獲得其中25個(gè)基因的全長編碼序列。序列分析顯示二化螟CYP基因的編碼

6、區(qū)約含1500bp的核苷酸，編碼500個(gè)氨基酸左右。72個(gè)CYP基因分屬于4個(gè)集團(tuán)、26個(gè)家族和37個(gè)亞家族，通過構(gòu)建二化螟、家蠶、蜜蜂和果蠅共261個(gè)P450氨基酸序列的進(jìn)化樹，證實(shí)了這些基因與昆蟲，尤其是鱗翅目昆蟲相應(yīng)CYP基因的親緣關(guān)系。通過脊椎動(dòng)物門和無脊椎動(dòng)物門的22個(gè)物種中CYP基因在4個(gè)集團(tuán)之間的分配比較，不僅發(fā)現(xiàn)CYP3基因集團(tuán)在昆蟲綱的物種中存在明顯的擴(kuò)增，還發(fā)現(xiàn)二化螟CYP6AB亞家族也存在明顯的擴(kuò)增，且可能與二化螟

7、降解寄主次生代謝物質(zhì)相關(guān)。此外，本研究還在二化螟CYP基因中首次發(fā)現(xiàn)新的CYP321F亞家族，由4個(gè)無內(nèi)含子的基因組成，且可能與二化螟的抗藥性相關(guān)。利用已在其他昆蟲中報(bào)道的31個(gè)抗性相關(guān)基因在二化螟的CYP基因中查找到10個(gè)同源基因，為二化螟抗藥性的深入研究奠定了扎實(shí)基礎(chǔ)。
　　3.二化螟中EST和GST基因的轉(zhuǎn)錄組分析
　　酯酶(EST)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和P450細(xì)胞色素多功能氧化酶都是昆蟲重要的解毒代謝酶。

8、本研究在已有工作的基礎(chǔ)上，綜合利用二化螟的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，搜索驗(yàn)證獲得了27條GST基因和17條新的的EST基因，使二化螟EST基因數(shù)達(dá)到51個(gè)，與已報(bào)道的鱗翅目昆蟲全基因組EST基因數(shù)相當(dāng)。對(duì)已有大于300aa的EST基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，30條二化螟EST基因中有8條與家蠶EST基因有1∶1的直系同源基因，有6條與棉鈴蟲EST基因有1∶1的直系同源基因，表現(xiàn)出明顯的親緣和較近的適應(yīng)進(jìn)化關(guān)系。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示30條酯酶基因中有

9、15條位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，有6條位于細(xì)胞外，4條位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，4條位于線粒體，1條位于細(xì)胞內(nèi)骨架。BlastX結(jié)果顯示二化螟的27條GST基因中的24條分別屬于theta、omega、epsilon、zeta、delta、sigma6個(gè)家族，3條屬于unclassified，它們與其他鱗翅目昆蟲GST具有最高的相似度。本研究為進(jìn)一步深入研究二化螟EST和GST基因家族中各基因的具體功能奠定了基礎(chǔ)。
　　4.二化螟解毒酶基因?qū)Σ煌瑲⑾x

10、劑的誘導(dǎo)響應(yīng)
　　外源化合物可以誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)的代謝酶，本研究通過亞致死劑量處理二化螟，分析了氯蟲苯甲酰胺、阿維菌素和三唑磷對(duì)二化螟P450、EST和GST基因的誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果表明阿維菌素誘導(dǎo)后二化螟中11個(gè)P450基因、8個(gè)EST基因和5個(gè)GST基因表達(dá)量出現(xiàn)了上調(diào)，氯蟲苯甲酰胺誘導(dǎo)后有9個(gè)P450基因、11個(gè)EST基因和3個(gè)GST基因的表達(dá)量上升，而三唑磷誘導(dǎo)后有19個(gè)P450基因、8個(gè)EST基因和4個(gè)GST基因的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)