二化螟四個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)及功能分析.pdf

1、昆蟲的內(nèi)外表皮都含有幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)大約占昆蟲表皮物質(zhì)的40％。昆蟲在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，會(huì)降解老的幾丁質(zhì)，合成新的幾丁質(zhì)。在這個(gè)過(guò)程中，昆蟲幾丁質(zhì)酶可以降解幾丁質(zhì)，它與昆蟲的蛻皮密切相關(guān)。本文以水稻重要害蟲二化螟為研究對(duì)象，對(duì)四個(gè)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下:
　　1)通過(guò)對(duì)二化螟基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的搜索，獲得了二化螟四個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的序列片段，應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)序列成功地進(jìn)行了驗(yàn)證，說(shuō)明二化螟基因組序列可靠性高。驗(yàn)證后的

2、序列在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)與其他物種的同源基因相似性達(dá)到50％-90％。結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，四個(gè)幾丁質(zhì)酶分別屬于第二組、第三組和第四組。
　　2)在二化螟不同發(fā)育時(shí)期取30個(gè)時(shí)間點(diǎn)，研究了四個(gè)幾丁質(zhì)酶在不同發(fā)育階段的表達(dá)量情況。定量PCR結(jié)果結(jié)果顯示，Cs-Cht1和Cs-Cht3在二化螟蛹期高表達(dá)，Cs-Cht2和Cs-Cht4在幼蟲期高表達(dá)。結(jié)果表明，Cs-Cht1和Cs-Cht3可能與二化螟的化蛹和羽化有

3、密切關(guān)系，Cs-Cht2和Cs-Cht4在二化螟幼蟲的蛻皮時(shí)期有重要作用。
　　3)利用RNA干擾技術(shù)，對(duì)二化螟的四個(gè)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行功能分析，結(jié)果顯示:Cs-Cht1、Cs-Cht2、Cs-Cht3、Cs-Cht4在二化螟不同發(fā)育階段具有不同的重要功能。在二化螟蛹期第四天注射Cs-Cht1的dsRNA后，處理組羽化時(shí)間延遲，并且出現(xiàn)不能正常展翅等畸形現(xiàn)象，表明Cs-Cht1在二化螟成蟲羽化階段具有重要作用。在二化螟預(yù)蛹試蟲中注射

4、dsCs-Cht3后，發(fā)現(xiàn)預(yù)蛹不能成功化蛹，表明此基因?qū)Χ幕加忻芮嘘P(guān)系。二化螟3L幼蟲注射Cs-Cht2和Cs-Cht4 dsRNA后，死亡率顯著升高。觀察表型發(fā)現(xiàn)，死亡試蟲呈現(xiàn)半蛻皮狀態(tài)。這些結(jié)果表明，隸屬第四組的Cs-Cht2和Cs-Cht4與二化螟幼蟲的蛻皮有關(guān)。
　　4)通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-11，miR-308，miR-316和miR-317等miRNA能夠作用于幾丁質(zhì)合成和代謝通路基因上，并且對(duì)作

5、用于幾丁質(zhì)酶基因上的四個(gè)miRNA進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及特征值分析，和其他物種的成熟體序列比對(duì)顯示相似性高。
　　幾丁質(zhì)酶基因主要存在于昆蟲體內(nèi)，高等植物和高等動(dòng)物體內(nèi)則不合幾丁質(zhì)。因此，選擇幾丁質(zhì)酶來(lái)破壞幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，達(dá)到防治害蟲的目的，具有極大的發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳耙延醒芯勘砻?，昆蟲幾丁質(zhì)酶與其他殺蟲因子，如桿狀病毒和蘇云金芽抱桿菌具有協(xié)同殺蟲作用。利用幾丁質(zhì)酶基因的RNAi進(jìn)行研究，可影響幾丁質(zhì)酶基因的正常表達(dá)，阻礙昆蟲的正常生長(zhǎng)發(fā)育