稻縱卷葉螟轉(zhuǎn)錄組及幾丁質(zhì)代謝途徑和抗藥性基因鑒定.pdf

1、稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)是一種重要的水稻害蟲(chóng)，由于遷徙特性而難以控制，每年在長(zhǎng)江中下游地區(qū)大量爆發(fā)。目前控制稻縱卷葉螟最主要的方法是依靠化學(xué)殺蟲(chóng)劑，對(duì)環(huán)境和人類(lèi)的生命安全產(chǎn)生重要影響，并且害蟲(chóng)的抗藥性與日俱增。幾丁質(zhì)作為一種線(xiàn)型高聚物主要存在于真菌細(xì)胞壁、昆蟲(chóng)表皮和圍食膜中，在昆蟲(chóng)抵御外界微生物入侵中起著關(guān)鍵作用。希望通過(guò)破壞昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)代謝途徑，有利于開(kāi)發(fā)殺蟲(chóng)劑作用的靶點(diǎn)，為進(jìn)一步防治稻縱卷葉螟奠定

2、基礎(chǔ)。迄今為止，稻縱卷葉螟在幾丁質(zhì)代謝與昆蟲(chóng)抗藥性方面的報(bào)道很少。由于稻縱卷葉螟全基因組測(cè)序尚未完成，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成為挖掘新基因，研究基因功能的重要方法。尤其在缺乏基因組信息的情況下，可以在轉(zhuǎn)錄水平獲得特定組織、器官和個(gè)體的基因信息，極大推動(dòng)了稻縱卷葉螟分子生物學(xué)的研究。
　　本研究通過(guò)對(duì)稻縱卷葉螟四齡幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得大量reads,經(jīng)過(guò)序列組裝與拼接得到Unigene；在基因注釋的基礎(chǔ)上鑒定幾丁質(zhì)代謝相關(guān)的酶以及代謝途徑，篩選抗

3、藥性相關(guān)的基因，為殺蟲(chóng)劑新靶標(biāo)的開(kāi)發(fā)以及藥劑代謝機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)；充分研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)掘功能性SSR，以期獲得可供遺傳研究的分子標(biāo)記。研究結(jié)果如下：
　　1．利用高通量測(cè)序技術(shù)Illumina HiSeqTM2000對(duì)稻縱卷葉螟四齡幼蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了29,367,797 reads，經(jīng)過(guò)Trinity軟件組裝得到相應(yīng)的Contig、Transcript數(shù)量，分別為3,381,765和106,407；運(yùn)用paired-e

4、nd joining和gap-filling技術(shù)拼接得到63,174個(gè)Unigene，平均堿基數(shù)為753 bp。將63,174個(gè)Unigene提交至NCBI Nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTx比對(duì)，設(shè)置閾值E為10-5，其中注釋到COG、GO、KEGG、Swiss-prot、Nr的數(shù)量分別為8,669、18,176、10,043、24,246和31,810個(gè)，總共有32,035個(gè)Unigene得到成功注釋。
　　2．對(duì)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLA

5、STx分析，設(shè)置閾值E為10-5,鑒定出16個(gè)與幾丁質(zhì)代謝相關(guān)的酶，包括：CHSA、CHSB、PGM、UNAP、NAGK、CHT1、CHT2、CHT3、CHT5、CHT7、Hex、CDA1、CDA2、CDA4、CDA5和CDA6，相應(yīng)序列已經(jīng)在Gene Bank登錄，再結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的KEGG pathway，以及參考相關(guān)的文獻(xiàn)，繪制出稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)代謝通路圖。采用 qRT-PCR驗(yàn)證和檢測(cè)三個(gè)主要酶類(lèi)基因：CmCHS1、CmCD

6、A1和 CmCHT1在中腸、表皮、幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)中的表達(dá)量。結(jié)果表明：CmCHS1在表皮中高表達(dá)，成蟲(chóng)的表達(dá)量高于幼蟲(chóng)；CmCHT1在表皮中高表達(dá)，幼蟲(chóng)表達(dá)量顯著高于成蟲(chóng)；CmCDA1在中腸中表達(dá)，成蟲(chóng)的表達(dá)量高于幼蟲(chóng)。
　　3．對(duì)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTx分析，設(shè)置閾值E為10-5，鑒定出378個(gè)分屬于15大類(lèi)的昆蟲(chóng)抗藥性相關(guān)的基因，包括細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、γ-氨基丁酸、乙酰膽堿受體、鈉離子通道、乙酰膽堿酯酶、水

7、通道蛋白、過(guò)氧化氫酶、鈣離子通道、氯離子通道、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、耐甲氧普靈、超氧化物歧化酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑。
　　4．利用轉(zhuǎn)錄組獲得的數(shù)據(jù)，挖掘稻縱卷葉螟SSR分子標(biāo)記，共挖掘到SSR標(biāo)記位點(diǎn)10,394個(gè)，其中單堿基5050個(gè)，雙堿基1826個(gè)，三堿基3408個(gè)，四堿基101個(gè)，6個(gè)五堿基和3個(gè)六堿基。
　　綜合以上結(jié)果，本研究通過(guò)對(duì)稻縱卷葉螟四齡幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定出16種幾丁質(zhì)代謝相關(guān)的酶，分析幾丁質(zhì)代謝途徑；鑒