桔小實蠅鈉離子通道基因和P450基因RNAi載體構建及對柑橘的轉化.pdf

1、桔小實蠅Bactrocera dorsalis又名東方果實蠅，廣泛分布于中國各大柑橘產區(qū)，使中國的柑橘產業(yè)面臨著嚴重威脅，每年都對柑橘為害造成巨大經濟損失。除此之外，還可危害柑橘、芒果和楊桃等250多種水果蔬菜和作物。目前化學防治仍是控制桔小實蠅的重要措施，然而化學農藥施用的不當，不僅影響果品安全，同時還會導致嚴重的抗性藥。因此，化學防治很難實現桔小實蠅的可持續(xù)控制。鈉離子通道(sodium channel，SC)基因是擬除蟲菊酯類和D

2、DT殺蟲劑對昆蟲的主要毒害作用靶標;細胞色素P450單加氧化酶系(cytochrome p450 monoxygenases，P450s)是一類在結構性質上類似的一族蛋白質，有報道表明，其與昆蟲對擬除蟲菊酯類和有機氯類殺蟲劑的抗性有關。應用RNAi技術可達到昆蟲鈉離子通道基因和P450基因不能正常表達，從而增強昆蟲對農藥的敏感性、影響其發(fā)育及繁殖，因此可以通過農桿菌介導植物遺傳轉化和RNAi技術獲得抗桔小實蠅材料。本試驗將鈉離子通道JN

3、416983基因以及P450 CYP6EK1基因的特異序列作為靶標序列，構建這兩個基因的RNA干擾載體，采用農桿菌介導轉化柑橘，旨在獲得對桔小實蠅有抗性的新材料。
　　1、RNAi干擾載體的構建
　　NCBI上搜索桔小實蠅鈉離子通道基因和細胞色素P450基因全長序列，Blast比對其保守序列，設計特異性的兩端加相應酶切位點的引物，構建dsRNA載體。
　　A.載體PFGC5941-C1R1/C2R2的構建:
　　

4、鈉離子通道基因正向目的片段與反向目的片段上游下游添加的限制性內切酶分別為XhoⅠ和NcoⅠ、XbaⅠ和BamHⅠ識別序列，克隆得到相應的正向和反向相重復的基因片段。將正向目標基因C1R1質粒進行酶切，同時將載體PFGC5941質粒用相同的兩個酶酶切，用T4連接酶將其連接，然后將連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，隨機挑選幾個單克隆菌落，用通用引物C1R1，PCR檢測篩選正確的單菌落，提取質粒，然后酶切驗證得到“PFGC5941-正向片段C1

5、R1”;將得到的“PFGC5941-C1R1”質粒進行酶切，同時用相同酶對反向目標基因C2R2進行酶切，T4連接酶連接，轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞，隨機挑選單克隆菌落，酶切驗證，得到載體“PFGC5941-正向片段C1R1/反向片段C2R2”。
　　B.載體PFGC5941-P1F1/P2F2的構建:
　　構建方法同上，在細胞色素P450基因正向目的片段兩端分別加上限制性內切酶XhoⅠ和NcoⅠ識別序列;在反向目的片段兩端分別加

6、上XbaⅠ和BamHⅠ識別序列，通過雙酶切，T4連接酶連接后轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，提取質粒，分別進行酶切及PCR擴增驗證，最終獲得載體“PFGC5941-正向片段P1F1/反向片段P2F2”。
　　2、由農桿菌介導柑橘的遺傳轉化和轉基因植株的驗證
　　將上述獲得的兩個質粒電擊法分別轉入到農桿菌EHA105菌株。PCR驗證后，用含有質?！癙FGC5941-正向片段C1R1/反向片段C2R2”的農桿菌侵染錦橙上胚軸，用除草劑