黃檗組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因體系的建立.pdf

1、黃檗具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值，由于黃檗的育苗條件要求較高，技術(shù)難度大，移栽成活率低，生長(zhǎng)緩慢，成材年限長(zhǎng)，因此在引種栽培上尚未大面積推廣，野生資源缺乏，且目前存在自然更新困難、干形不通直、人工林種子敗育等問(wèn)題。本研究針對(duì)黃檗現(xiàn)有問(wèn)題，利用黃檗成熟合子胚建立了黃檗的快速高效的組培體系和轉(zhuǎn)基因體系，為黃檗優(yōu)良品種的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。 1．組織培養(yǎng)方面的研究表明：黃檗種子在6-BA和NAA作用下愈傷組織發(fā)生的最早，28℃條件下添加4.0

2、 mg/LTDZ和0.2 mg/LNAA的培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)率最高，為92.93％，平均誘導(dǎo)的不定芽個(gè)數(shù)最多，為25.03。最有利于黃檗不定芽生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基配比為添加2％蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基。添加4.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基對(duì)不定芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)最有效，兩周凈生長(zhǎng)量達(dá)到3.75 cm。添加1.0 mg/L IBA的培養(yǎng)基中不定芽根的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到85％。添加1.0 mg/L2,4-D或添加4.0 mg/

3、LTDZ和0.2 mg/LNAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，誘導(dǎo)率分別為16.67％、1.22％和32.26％和2.02％。黃檗的胚乳在添加4.0 mg/LBA和0.2 mg/LNAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出一棵不定芽。 2．黃檗轉(zhuǎn)基因體系建立的研究表明：侵染時(shí)將種子縱切成兩半的方法既有利于農(nóng)桿菌的侵染，又能獲得較高的抗性芽誘導(dǎo)率。抗性芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加200 mg/L的頭孢霉素和10 mg/L的卡那霉素。最佳的共培養(yǎng)時(shí)間為28℃2d+4

4、℃2d，抗性芽誘導(dǎo)率達(dá)38.8％。共培養(yǎng)時(shí)期保留胚乳，共培養(yǎng)結(jié)束后清洗過(guò)程中剝離胚乳再轉(zhuǎn)入抗性芽篩選培養(yǎng)基能獲得更高效的抗性芽誘導(dǎo)率，并容易控制試驗(yàn)材料外部菌類(lèi)的生長(zhǎng)?？剐匝吭谠鲋臣吧扉L(zhǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中，芽基部愈傷組織塊切成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm左右為宜。試驗(yàn)共獲得70個(gè)轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行DNA水平上的PCR，結(jié)果均為陽(yáng)性。隨機(jī)挑選其中的5個(gè)黃檗轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR-southem檢測(cè)，RNA水平上的RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示外