基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的黃瓜單性結(jié)實分子調(diào)控機理研究.pdf

1、黃瓜（CucumissativusL.）在世界各地廣泛種植，市場需求巨大。部分的黃瓜品種具有單性結(jié)實特性，能在不受粉的情況下正常結(jié)實，對減少人工授粉、提高黃瓜產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要意義。許多設(shè)施黃瓜栽培品種缺乏單性結(jié)實性狀，普遍存在坐果受環(huán)境影響大、單性結(jié)實能力弱等問題，極大地影響了黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此選育黃瓜單性結(jié)實品種是目前重要的育種目標(biāo)之一，研究單性結(jié)實機理也成為黃瓜分子育種的熱點之一，發(fā)掘單性結(jié)實基因資源，對改良黃瓜栽培品種有著重

2、要的意義。本文主要以黃瓜單性結(jié)實品種‘EC1’和非單性結(jié)實品種‘8419s-1’為試材，借助RNA-Seq技術(shù)發(fā)掘與單性結(jié)實果實坐果相關(guān)的基因，利用基因瞬時表達方法對部分的黃瓜單性結(jié)實候選基因進行快速的初步功能驗證。另外，選取RNA-Seq分析中表達差異明顯的兩個生長素受體基因CsTIR1和CsAFB2進行深入研究，明確其在單性結(jié)實果實發(fā)育中的時空表達變化，分析外源激素對其表達水平的影響，并對CsTIR1基因進行轉(zhuǎn)番茄(MicroTom

3、)功能驗證。最后，本論文還分析了細胞分裂相關(guān)基因(CYCD)在單性結(jié)實果實發(fā)育早期的表達趨勢。以上研究取得了以下主要結(jié)果:
　　1.利用RNA-Seq技術(shù)發(fā)掘黃瓜單性結(jié)實調(diào)控基因及其部分候選基因的功能分析
　　選擇開花后2天的幼果，借助RNA-Seq技術(shù)，通過比較分析，共獲得1339個與單性結(jié)實坐果相關(guān)的基因，其中759個基因在單性結(jié)實坐果中是上調(diào)的，580個基因出現(xiàn)下調(diào)。在這些差異表達的基因中，與激素相關(guān)的基因表達模式支持

4、植物激素是坐果關(guān)鍵因子的觀點。選取了其中的12個差異表達基因在單性結(jié)實和非單性結(jié)實果實發(fā)育的早期進行表達水平分析，結(jié)果證明所選的基因在單性結(jié)實果實中起到重要的調(diào)控作用。
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達方法對10個與生長素、細胞分裂素和赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的，且在黃瓜單性結(jié)實果實中特異表達的基因進行功能分析。結(jié)果表明，在外源基因?qū)朦S瓜10天后，黃瓜子房，出現(xiàn)以下幾種狀態(tài):果實膨大、子房停止發(fā)育但不萎蔫、“化瓜”。利用GUSassay進

5、行檢測，結(jié)果顯示，除在萎蔫的子房中GUS染色是陰性以外，其他兩種狀態(tài)的子房GUS染色均是陽性，因此推測在萎蔫子房中外源基因沒有瞬時表達。所選的基因當(dāng)中，與生長素信號相關(guān)的兩個基因Csa6M125240.1和Csa3M597350.1在黃瓜單性結(jié)實形成中起到了負調(diào)控作用;細胞分裂素合成相關(guān)基因Csa5M166390.1和赤霉素合成相關(guān)基因Csa3M015360.1的正向瞬時表達都可以導(dǎo)致黃瓜單性結(jié)實的形成。上述研究表明，所選的10個激素信

6、號基因能夠誘導(dǎo)單性結(jié)實的形成。
　　2.CsTIR1/AFB基因的表達分析及功能研究
　　選擇RNA-Seq中差異明顯的兩個生長素受體基因進行深入研究。結(jié)果表明，黃瓜單性結(jié)實相關(guān)的CsTIR1和CsAFB2分別在黃瓜的子葉和子房中表達量最高，在黃瓜果實發(fā)育早期其表達量隨著坐果完成逐漸下降，而在沒有成功坐果的子房中其表達量隨著子房萎蔫程度的加深逐漸上升。NAA處理后6h，CsTIR1和CsAFB2基因的表達量緩慢上調(diào)，在處理后

7、9h開始下調(diào)，而且隨著NAA濃度從5到50μM的增加，CsTIR1和CsAFB2的表達量基本是一致的。CsTIR1在6-BA處理后3h表達量達到最大值，然后開始下降。與CsTIR1不同，CsAFB2的表達量在6h后才開始下降。另外，在GA3的處理下CsTIR1和CsAFB2的反應(yīng)也不一致，葉片經(jīng)GA3處理后6hCsTIR1基因表達量達到最大值，而CsAFB2基因在處理后3h到9h時間范圍內(nèi)的表達量幾乎沒有變化。ABA和乙烯利處理后，這兩

8、個基因的表達量都上調(diào)。以上結(jié)果揭示CsTIR1和CsAFB2在黃瓜果實發(fā)育的過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，其下調(diào)表達可能是成功坐果的關(guān)鍵;CsTIR1和CsAFB2基因?qū)ν庠醇に囟加蟹磻?yīng)，雖然是同一個家族但其反應(yīng)程度和時間不同;ABA和乙烯后其上調(diào)表達說明這兩個基因可能參與植物的逆境過程。
　　為了研究黃瓜CsTIR1基因的功能，以番茄的子葉為外質(zhì)體，對黃瓜的CsTIR1基因進行功能驗證。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)超表達CsTIR1基因的番茄出現(xiàn)單

9、性結(jié)實的現(xiàn)象，同時轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出植株矮化特點。研究表明黃瓜CsTIR1基因在單性結(jié)實形成過程中起到重要的調(diào)控作用。
　　3.黃瓜果實發(fā)育調(diào)控基因CsCYCDs的克隆與表達分析
　　從RNA-Seq數(shù)據(jù)分析中，獲得關(guān)于細胞分裂的D型細胞周期蛋白家族基因(CYCD)，為研究單性結(jié)實果實發(fā)育早期的細胞分裂情況，分析了CYCD家族基因在果實發(fā)育早期的表達特征。在果實發(fā)育早期，CsCYCDs的表達趨勢表明天然單性結(jié)實果實與授粉果實細

10、胞分裂主要發(fā)生在開花后第4天。另外，大部分CYCD基因在天然單性結(jié)實果實中的表達模式與授粉果實的一樣，但是不同于誘導(dǎo)的單性結(jié)實。以上結(jié)果表明CYCD基因家族在天然單性結(jié)實果實發(fā)育早期起著重要的調(diào)控作用，使得單性結(jié)實的子房不依賴于授粉便可以進行果實發(fā)育所必須的細胞分裂。
　　綜上所述，黃瓜單性結(jié)實果實發(fā)育是一個復(fù)雜的分子調(diào)控過程。本研究發(fā)掘了黃瓜單性結(jié)實的候選基因，并對其中的部分基因進行功能驗證，明確了一些基因在單性結(jié)實果實發(fā)育過程