鱖與草魚攝食調(diào)控轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較研究.pdf

1、作為一種重要的經(jīng)濟(jì)性狀，動(dòng)物的攝食行為及其對(duì)食物的偏好性直接影響著養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)成本和收益。目前，雖然對(duì)動(dòng)物攝食行為和食物攝入量的研究已有許多，但對(duì)于食物偏好性的問題了解很少。動(dòng)物的食物偏好受遺傳、環(huán)境等多種因素的影響。然而，決定食物偏好的基因和相關(guān)遺傳因素仍未知。雖然有些基因被報(bào)道參與了食物偏好的形成，但轉(zhuǎn)錄組水平上如何決定動(dòng)物的特殊食物偏好，如鱖活餌食性、草魚食性轉(zhuǎn)變，尚知之甚少。
　　鱖（Mandarin fish）作為一種底

2、棲兇猛性魚類，食性非常特殊，從開口攝食起，只吃活餌料魚蝦，一般不攝食死魚或人工餌料。盡管鱖馴食人工飼料的技術(shù)、飼料營(yíng)養(yǎng)配方和工藝及小規(guī)模養(yǎng)殖試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)外已有研究突破，但鱖個(gè)體馴食有難易之分，對(duì)人工飼料攝食和利用的個(gè)體差異很大，大部分個(gè)體攝食和利用人工飼料效率低。因此，對(duì)于鱖馴食人工飼料分子機(jī)理的研究具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。為闡明基因表達(dá)與鱖馴食性狀的關(guān)系，我們對(duì)易馴食與不易馴食死餌料魚的鱖進(jìn)行了de novo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及數(shù)字基因

3、表達(dá)譜測(cè)序。
　　對(duì)易馴食與不易馴食鱖的高質(zhì)量reads進(jìn)行組裝，分別獲得了665466、716044個(gè)Contigs，兩組Contig的平均長(zhǎng)度分別達(dá)到了142、141bp。去除部分重疊序列后，共得到118218個(gè)基因序列(All-Unigene)，平均長(zhǎng)度為506 bp。這些功能基因中，69.5％（82108個(gè)）基因的長(zhǎng)度在100 bp到500bp之間，30.5％（36110個(gè)）基因的長(zhǎng)度超過500 bp，9.8％（11550

4、個(gè)）基因的長(zhǎng)度大于1000 bp，這為鱖馴食性狀相關(guān)研究提供了大量序列。將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的Unigene與NCBI、Swiss-Prot、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)(E value＜0.00001)，發(fā)現(xiàn)共有49155個(gè)基因(All-Unigene中的41.6％)獲得功能注釋。BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)鱖與斑馬魚（Danio rerio，52％）顯示高度同源性，其次是大西洋鮭(Salmo salar，9％)，斑點(diǎn)綠河豚（Tet

5、raodon nigroviridis，4％）。此外，鱖轉(zhuǎn)錄組序列也與其它四種魚類同源，包括日本河豚（Takifugu rubripes），裸頭魚（Anoplopomafimbria），彩虹胡瓜魚（Osmerus mordax）以及青鳉（Oryzias latipes）。這些結(jié)果表明鱖與其它物種間存在進(jìn)化的保守性，尤其是模式生物斑馬魚。
　　被注釋的49155個(gè)鱖轉(zhuǎn)錄組序列中，14228(28.9％)個(gè)序列具有一個(gè)或者多個(gè)GO功能

6、定義?？傆?jì)獲得106024個(gè)GO功能定義，其中46.1％參與生物過程，34.8％涉及細(xì)胞組分，9.1％描述分子功能。共30964個(gè)序列參與205個(gè)已知的新陳代謝或信號(hào)通路，其中代表性通路有MAPK信號(hào)通路(1222個(gè)Unigene)，鈣離子信號(hào)通道（913個(gè)Unigene），胰島素信號(hào)通路（711個(gè)Unigene），長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)(542個(gè)Unigene)，長(zhǎng)時(shí)程抑制（369個(gè)Unigene），味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)(173個(gè)Unigene)，

7、哺乳動(dòng)物生理節(jié)律（92個(gè)Unigene）。我們?cè)谝遵Z食鱖中檢測(cè)到4768個(gè)潛在SNP位點(diǎn)，在不易馴食鱖中檢測(cè)到41個(gè)潛在SNP位點(diǎn)，SNP頻率為每12430bp一個(gè)SNP，共4809個(gè)SNP位點(diǎn)，其中1592個(gè)轉(zhuǎn)換，3217個(gè)顛換。共在17933(15.2％)個(gè)Unigene中找到了22418個(gè)可能的SSR位點(diǎn)，頻率為每2.7 kbUnigene中存在一個(gè)可能的SSR。
　　利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序，通過比較易馴食與不易馴食

8、鱖的mRNA表達(dá)水平，分別得到了1986與4525個(gè)差異表達(dá)基因(False Discovery Rate(FDR)＜0.001，fold-change≥2)。這些基因涉及多個(gè)信號(hào)通路，包括視覺通路（視網(wǎng)膜G蛋白偶聯(lián)受體(Rgr)，視黃醇脫氫酶（Rdh8，細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白（Crbp）和鳥氨酸環(huán)化酶(Gc));晝夜節(jié)律通路（周期蛋白1（Per1），周期蛋白2(Per2)，Rev-erba，酪蛋白激酶(Ck)和黑夜因子（Nocturnin

9、））;食欲調(diào)控通路（神經(jīng)肽Y（Npy），生長(zhǎng)激素（Gh），阿片促黑皮素（Pomc），肽YY(Pyy)，胰島素(Insulin)和瘦素（Leptin））;學(xué)習(xí)和記憶通路（環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（Creb），c-fos，fos相關(guān)抗原2(Fra-2)，CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP），zif268，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Bdnf)和突觸結(jié)合蛋白(Syt)）。這些差異表達(dá)的功能基因都與鱖活餌食性這種獨(dú)特的食物偏好密切相關(guān)。馴食性狀（死餌

10、食性）的獲得可能與視覺能力的提高、生理節(jié)律的重置、食欲的減少、記憶保持的抑制，以及豐富的等位基因變化密切相關(guān)。
　　草魚是脊椎草食性動(dòng)物中存在天然食性轉(zhuǎn)變現(xiàn)象的一個(gè)十分理想的研究模型，現(xiàn)被廣泛養(yǎng)殖于中國(guó)及其他許多國(guó)家用作食用魚或水生植物的生物控制劑。草魚在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中，會(huì)經(jīng)歷從肉食性向草食性的轉(zhuǎn)變。全長(zhǎng)小于3厘米的草魚為肉食性，全長(zhǎng)在3-5.5厘米的草魚處于從攝食浮游動(dòng)物和底棲動(dòng)物向攝食水生植物的過渡階段，而全長(zhǎng)超過5.5厘米

11、的草魚為草食性。然而，目前對(duì)這一食性轉(zhuǎn)變過程中的相關(guān)基因，以及草魚如何能高效利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量較低的植物餌料及其分子機(jī)制的研究尚屬空白。為了闡明基因表達(dá)和草食性形成之間的關(guān)系，我們對(duì)轉(zhuǎn)食前后草魚進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
　　轉(zhuǎn)食后草魚（C組）的比腸長(zhǎng)顯著大于轉(zhuǎn)食前草魚（A組）和人為不轉(zhuǎn)食草魚（B組）。為了得到草魚轉(zhuǎn)食前后基因表達(dá)情況，我們構(gòu)建了9個(gè)cDNA文庫(kù)，包括:草魚轉(zhuǎn)食前腦組織文庫(kù)(AB)，轉(zhuǎn)食前肝臟組織文庫(kù)(AL)，轉(zhuǎn)食前腸道組織

12、文庫(kù)(AG);草魚人為不轉(zhuǎn)食腦組織文庫(kù)(BB)，人為不轉(zhuǎn)食肝臟組織文庫(kù)(BL)，人為不轉(zhuǎn)食腸道組織文庫(kù)(BG);草魚轉(zhuǎn)食后腦組織文庫(kù)(CB)，轉(zhuǎn)食后肝臟組織文庫(kù)(CL)，轉(zhuǎn)食后腸道組織文庫(kù)(CG)，并使用Illumina公司HiSeq2000測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。去除低質(zhì)量reads后，我們于AB組得到64914000個(gè)clean reads，于AL組得到62801686個(gè)clean reads，于AG組得到62679236個(gè)clean r

13、eads，于BB組得到66466322個(gè)clean reads，于BL組得到65442204個(gè)clean reads，于BG組得到63096538個(gè)clean reads，于CB組得到62196672個(gè)clean reads，于CL組得到62079494個(gè)clean reads，于CG組得到66338198個(gè)clean reads。約66.32-76.59％的clean reads可以比對(duì)到草魚基因組，30.60-55.24％的clea

14、n reads可以比對(duì)到基因。我們?cè)贏、B、C組中共找到15739、16380和16826個(gè)可變剪接事件。分別于AB、AG、AL、BB、BG、BL、CB、CG和CL組中預(yù)測(cè)到69520、43953、26592、49109、41754、16897、46457、36675和18331個(gè)新轉(zhuǎn)錄本。分別于AB、AG、AL、BB、BG、BL、CB、CG和CL組中檢測(cè)到65015、48001、17759、61761、40721、16683、5960

15、1、41561和18770潛在的SNP位點(diǎn)。369872個(gè)潛在SNP位點(diǎn)，包括262250個(gè)轉(zhuǎn)換和107622個(gè)顛換。
　　我們?cè)贏組和C組之間發(fā)現(xiàn)10184個(gè)差異表達(dá)基因，在A組和B之間發(fā)現(xiàn)8711個(gè)差異表達(dá)基因，B組和C之間發(fā)現(xiàn)4435個(gè)差異表達(dá)基因。在腦組織和腸道組織之間發(fā)現(xiàn)40149個(gè)差異表達(dá)基因，在腦組織和肝臟組織之間發(fā)現(xiàn)47849個(gè)差異表達(dá)基因，在肝臟組織和腸道組織之間發(fā)現(xiàn)35434個(gè)差異表達(dá)基因(FDR≤0.001，

16、fold-change≥2)。為了消除草魚自身發(fā)育引起的差異表達(dá)，我們將在A組和C組之間差異表達(dá)，而不在A組和B組之間差異表達(dá)的基因認(rèn)為是參與草魚食性轉(zhuǎn)變的功能差異表達(dá)基因。并將這些差異表達(dá)基因比對(duì)到京都百科全書基因與基因組(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)來找出與草魚食性轉(zhuǎn)變相關(guān)的典型生物學(xué)途徑。我們發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)信號(hào)通路的大量基因在草魚食性轉(zhuǎn)變前后存在著差異表達(dá)，包括細(xì)胞增殖和分化

17、、食欲控制、晝夜節(jié)律、以及消化和代謝通路。此外，上述這些差異表達(dá)基因中56％存在可變剪切，草魚中這些差異表達(dá)基因的基因結(jié)構(gòu)與斑馬魚相應(yīng)基因的基因結(jié)構(gòu)不同，這表明草魚的獨(dú)特基因結(jié)構(gòu)可能決定了其獨(dú)特的食性轉(zhuǎn)變。這些潛在的因素為草食性形成分子機(jī)制提供了遺傳研究基礎(chǔ)。闡明草魚從肉食性向草食性轉(zhuǎn)變過程中相關(guān)基因及其信號(hào)通路，有助于更好地了解草魚及其他草食性動(dòng)物對(duì)植物性飼料高攝食、高利用的機(jī)制，也能更好地研究物種進(jìn)化過程中草食性動(dòng)物的形成機(jī)制。此外