具胃毒殺蟲(chóng)活性的球孢白僵菌工程菌劑對(duì)甘藍(lán)害蟲(chóng)的整季田間防效和安全性評(píng)價(jià).pdf

1、基于活體細(xì)胞的真菌殺蟲(chóng)菌劑時(shí)效性較差，限制其商業(yè)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。生防真菌轉(zhuǎn)基因工程菌劑在很大程度能克服殺蟲(chóng)時(shí)效性較差的缺點(diǎn)，但繞不開(kāi)環(huán)境安全性的公眾疑慮，而目前缺乏轉(zhuǎn)基因真菌殺蟲(chóng)劑田間殺蟲(chóng)效果和安全性評(píng)價(jià)的實(shí)例。本研究以先前構(gòu)建的超高表達(dá)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)殺蟲(chóng)蛋白Vip3Aal而對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)表現(xiàn)高胃毒殺蟲(chóng)活性的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)工程菌株BbHV8及其親本野生株Bb2

2、860(簡(jiǎn)稱WT)為材料，將其高純度分生孢子粉配制成孢子懸乳劑(emulsifiable formulation)，在浙江金華從初夏開(kāi)始進(jìn)行了兩個(gè)獨(dú)立的各歷時(shí)35天防治以菜青蟲(chóng)(Pieris rapae)為主、小菜蛾(Plutella xylostella)和桃蚜(Myzuspersicae)為輔的田間試驗(yàn)，一是比較兩種菌劑與當(dāng)家化學(xué)殺蟲(chóng)劑甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（簡(jiǎn)稱甲維鹽）在根據(jù)蟲(chóng)情四次用菌用藥條件下對(duì)卷心甘藍(lán)的整季保護(hù)效果;二是在試

3、驗(yàn)期間評(píng)價(jià)了各處理對(duì)田間捕食性天敵蜘蛛種群的影響，試驗(yàn)之后數(shù)月期間多批次采樣評(píng)價(jià)兩種菌劑在釋放環(huán)境中的存留狀況、環(huán)境適應(yīng)性及其對(duì)土壤真菌群落的影響，作為其環(huán)境安全性的評(píng)判依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，探索了利用工程菌中靶基因的引物在實(shí)時(shí)定量熒光PCR中的特異性，通過(guò)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線快速定量檢測(cè)甘藍(lán)葉片上和環(huán)境土壤樣品中工程菌含量的可能性，為工程菌劑的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)和管控提供技術(shù)參考。主要結(jié)果摘要如下:
　　 工程菌劑BbHV8對(duì)甘藍(lán)的整季保護(hù)效

4、果與甲維鹽匹敵在夏季由水稻和玉米作物包圍的兩地塊中分別于4月2日和12日移載的甘藍(lán)，很快誘集菜粉蝶等鱗翅目害蟲(chóng)前來(lái)產(chǎn)卵，田間菜青蟲(chóng)分別于4月22日和5月5日達(dá)到0.94±0.06和0.93±0.05頭/株甘藍(lán)(mean±SEM)的蟲(chóng)口密度，大大超過(guò)0.5頭/株的經(jīng)濟(jì)危害閾值，故作為試驗(yàn)1和試驗(yàn)2用菌用藥處理的起始日。兩試驗(yàn)均包括4個(gè)處理，即BbHV8和WT的懸乳劑(1010個(gè)孢子/mL)100倍稀釋液機(jī)動(dòng)彌霧（用菌量均為1013個(gè)孢子/

5、公頃）、5％甲維鹽水分散粒劑按標(biāo)簽用量機(jī)動(dòng)彌霧（標(biāo)準(zhǔn)化防）及配制孢子懸乳劑的乳油100倍稀釋液機(jī)動(dòng)彌霧（空白對(duì)照），每處理4個(gè)小區(qū)(6×11 m)，隨機(jī)區(qū)組排列。試驗(yàn)1首次彌霧后間隔10天重復(fù)用菌用藥，每隔5天抽樣調(diào)查各處理中菜青蟲(chóng)、小菜蛾及蚜蟲(chóng)密度，第25天對(duì)照中菜青蟲(chóng)蟲(chóng)口達(dá)16.1±1.0頭/株，而B(niǎo)bHV8、WT及甲維鹽處理中分別為4.3±0.3、8.2±0.8和1.3±0.2頭/株;首次藥后20天，在BbHV8、WT、甲維鹽和對(duì)

6、照中小菜蛾蟲(chóng)口分別0.40±0.08、0.45±0.06、0.75±0.06及1.50±0.15頭/株，第35天分別為0.15±0.05、0.28±0.09、1.95±0.64及0.13±0.05頭/株。試驗(yàn)1中桃蚜初始密度為12.7±1.1頭/株，首次藥后15天甲維鹽處理區(qū)蚜蟲(chóng)數(shù)量上升，第35天68.6±3.2頭/株，而同期BbHV8處理區(qū)僅為10.9±1.5頭/株。試驗(yàn)2的蟲(chóng)情與試驗(yàn)1相近，但對(duì)照處理菜青蟲(chóng)密度于第10天高達(dá)27.7

7、±2.0頭/株，于是分別在首次藥后第5天和第15天重復(fù)用菌用藥，最終試驗(yàn)2各處理的控蟲(chóng)效果優(yōu)于試驗(yàn)1。
　　 由于兩試驗(yàn)中都是暴食性菜青蟲(chóng)主導(dǎo)危害甘藍(lán)，對(duì)照葉片損毀十分嚴(yán)重，且被損毀植株上的菜青蟲(chóng)就近轉(zhuǎn)移到可取食的植株，使田間抽樣調(diào)查的蟲(chóng)口數(shù)難以真實(shí)反映甘藍(lán)受害狀況，故調(diào)查時(shí)根據(jù)每株甘藍(lán)葉片損失率分為5級(jí)，作為各處理相對(duì)防效和綜合保護(hù)效果的評(píng)價(jià)依據(jù)。結(jié)果表明，試驗(yàn)1中BbHV8、WT和甲維鹽歷次抽樣調(diào)查的相對(duì)防效分別為65～75

8、％、15～58％和42～85％，平均防效分別為70.5％(±1.2)、30.9％(±6.1)和69.7％(±6.9)。試驗(yàn)2期間上述三處理的相對(duì)防效波動(dòng)范圍分別為49～80％、41～70％和51～90％，平均防效分別為74.5％(±4.3)、48.4％(±4.2)和83.5％(±5.5)。兩個(gè)試驗(yàn)中，工程菌劑BbHV8與甲維鹽的總體防效相似或相近，都顯著高于WT。后者對(duì)害蟲(chóng)有一定的控制作用，但當(dāng)菜青蟲(chóng)暴發(fā)時(shí)，難以及時(shí)控制蟲(chóng)口數(shù)量而對(duì)甘藍(lán)

9、予以有效保護(hù)。
　　 在試驗(yàn)2期間補(bǔ)充進(jìn)行了兩種菌劑相同用菌量下對(duì)暴食性4齡菜青蟲(chóng)的田間生物測(cè)定，測(cè)得BbHV8對(duì)4齡菜青蟲(chóng)的LT5o和LT95分別為1.6(1.2～1.9)和4.5(4.3～4.8)天，而WT的LT5o和LT95分別為5.7(5.4～6.0)和11.5(10.6～12.8)天。這一結(jié)果說(shuō)明， BbHV8毒殺4齡菜青蟲(chóng)50％和95％比WT分別快4天和7天。
　　 工程菌劑BbHV8的生態(tài)安全性在田間試驗(yàn)1

10、和2期間的歷次抽樣調(diào)查中，BbHV8和WT菌劑處理對(duì)田間蜘蛛種群均未見(jiàn)負(fù)面影響，BbHV8由于較好保護(hù)了甘藍(lán)，對(duì)田間蜘蛛種群有所助增，而甲維鹽處理區(qū)蜘蛛數(shù)量一直低于菌劑處理區(qū)。
　　 在試驗(yàn)1最后一次用菌后次日、30天內(nèi)每隔10天、半年內(nèi)每隔一個(gè)月采集用菌和對(duì)照處理小區(qū)的表層土壤(0-5 cm)，帶回實(shí)驗(yàn)室分別選擇性分離培養(yǎng)球孢白僵菌與腐生絲狀真菌并統(tǒng)計(jì)每克土樣中的菌落形成單位(CFU)數(shù)量。結(jié)果顯示，WT和BbHV8小區(qū)噴菌后

11、次日每克土壤（干重）中球孢白僵菌CFU含量分別達(dá)3.1(±0.4)×104和2.1(±0.4)×104個(gè)，10天后降為4.3(±0.2)×103和3.2(±0.2)×103個(gè)，20天后降為3.8(±0.7)×102和4.1(±0.8)×102個(gè)，此后低水平徘徊，第120天后分別降至145±59和36±36個(gè)，再往后采集的土樣中再未分離到球孢白僵菌。對(duì)照小區(qū)中僅在用菌后第20和30天的每克土樣中分離到69±40和34±34個(gè)CFU，顯示田

12、間雨水等因素可導(dǎo)致白僵菌在地塊內(nèi)的輕微擴(kuò)散。各批次土樣中分離培養(yǎng)的腐生真菌CFU數(shù)量雖有季節(jié)性變化，但同批次樣品中的CFU含量在兩菌劑與對(duì)照處理間均無(wú)顯著差異。
　　 將用菌后30天、60天和90天的球孢白僵菌土壤分離物各選24株共72株，每次來(lái)自BbHV8和WT小區(qū)的各12株，通過(guò)PCR檢測(cè)它們是否攜帶殺蟲(chóng)蛋白基因vip3Aa1基因。結(jié)果顯示，來(lái)自用菌后30天WT小區(qū)的12株菌有2株呈陽(yáng)性，而源于BbHV8小區(qū)的12株菌中也有

13、2株呈陰性;用菌后60天的分離物鑒定結(jié)果，來(lái)自WT處理小區(qū)的白僵菌全為陰性，來(lái)自BbHV8小區(qū)的僅有1株呈陰性;用菌后90天的土樣分離株中，來(lái)自BbHV8小區(qū)的全為陽(yáng)性，而來(lái)自WT小區(qū)的全為陰性。顯然，所用菌劑由于雨水涇流等原因在地塊內(nèi)存在擴(kuò)散或相互串染的現(xiàn)象，但串染率不超過(guò)17％，且隨著田間存留量的減少，串染比率降低，最后消失。
　　 用菌后90天BbHV8和WT小區(qū)的土壤分離株rHV8和rWT在SDAY平板上培養(yǎng)8天的產(chǎn)孢量

14、分別比BbHV8和WT下降26.5％和32.4％，而且rHV8培養(yǎng)8天的菌落直徑比BbHV8小32.2％; rWT雖比WT生長(zhǎng)快9.1％，但菌落產(chǎn)孢量大幅下降。環(huán)境脅迫試驗(yàn)表明，BbHV8分生孢子耐UV-B輻射和45℃高溫的能力分別比WT低19.2％和12.5％，rHV8比BbHV8分別低32.5％和38.9％，rWT比WT分別低39.7％和31.0％?？傮w看，BbHV8和Bb2860在釋放環(huán)境中的生態(tài)適應(yīng)能力呈下降趨勢(shì)，且前者的生態(tài)適

15、應(yīng)能力弱于后者。
　　 工程菌劑BbHV8在釋放環(huán)境中存留量的快速定量檢測(cè)技術(shù)探索通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增融解曲線對(duì)靶基因vip3Aa1引物特異性的分析建立擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用靶基因在BbHV8細(xì)胞中單拷貝的特性，以含分生孢子的甘藍(lán)葉片和土壤樣品的總DNA提取物為模板，探索建立甘藍(lán)和土壤樣品中孢子含量的快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，菜葉上孢子的檢測(cè)精度可達(dá)2個(gè)孢子/mm2，土壤中也可檢出1～2個(gè)孢子/mg干土。然而，土壤成份復(fù)雜，影響