球孢白僵菌四個(gè)Septin基因的功能解析與無外源抗性標(biāo)記表達(dá)殺蟲蛋白Vip3Aa1的工程菌構(gòu)建.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是重要的昆蟲病原真菌，目前廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的生物防治。其制劑的有效成份為活體分生孢子，田間殺蟲效果的穩(wěn)定性及持效性受作物環(huán)境或季節(jié)性因素的制約，如環(huán)境溫度、紫外線輻射、化學(xué)農(nóng)藥等。因此，研究發(fā)掘球孢白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆性狀的調(diào)控基因服務(wù)于菌株的遺傳改良，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)，通過基因工程技術(shù)在提高生防真菌生防潛能的同時(shí)盡可能降低環(huán)境安全性風(fēng)險(xiǎn)，是需要探索的重要技術(shù)難題。因此，本論文

2、開展了兩方面的研究工作，一是研究解析了球孢白僵菌Septin基因家族的基本生物學(xué)功能，二是探索了利用內(nèi)源乳清酸核苷5一磷酸脫羧酶基因ura3作為營(yíng)養(yǎng)缺陷型安全性標(biāo)記，在球孢白僵菌中表達(dá)昆蟲中腸特異性胃毒蛋白Vip3Aa1而構(gòu)建低風(fēng)險(xiǎn)工程菌株的可能性。
　　球孢白僵菌Septin基因家族的功能解析 Septin是在進(jìn)化上高度保守的一類GTP結(jié)合蛋白，在結(jié)構(gòu)上與Ras GTP激酶家族的成員相似。在球孢白僵菌中存在4個(gè)Septin蛋白(

3、BspA/B/C/D)，與12種代表性絲狀真菌中對(duì)應(yīng)蛋白的同源性達(dá)到79％以上。Septin基因的缺失在不同程度上影響球孢白僵菌的萌發(fā)、生長(zhǎng)及分生孢子形成。敲除株的分生孢子萌發(fā)提速，但菌絲細(xì)胞隔膜形成滯后且數(shù)量減少，以致生長(zhǎng)受到抑制，尤在果糖作為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上表現(xiàn)較嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上正常培養(yǎng)期間，分生孢子產(chǎn)量在敲除株△bspA中下降80～89％，在△bspB中下降49～67％，在△bspC中下降60～76％，在△bs

4、pD中下降10～39％。在脅迫應(yīng)答測(cè)定中，敲除株在生長(zhǎng)期間對(duì)胞壁干擾劑剛果紅的敏感性升高，而對(duì)強(qiáng)氧化劑及高滲劑的敏感性則有所降低。其分生孢子耐高溫和紫外輻射能力也有所變化。其中，△bspA耐高溫、耐紫外輻射能力均有所下降，△bspD僅表現(xiàn)耐紫外輻射的能力下降，而△bspB耐高溫能力增強(qiáng)，△bspC耐紫外輻射能力提高。但是，敲除株對(duì)大蠟螟幼蟲的毒力與野生株和回補(bǔ)株相比未見有實(shí)質(zhì)性的變化。結(jié)果表明，4個(gè)septin蛋白不僅是球孢白僵菌萌發(fā)生

5、長(zhǎng)、細(xì)胞分隔、產(chǎn)孢的重要調(diào)控因子，還參與多脅迫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控，但與毒力無顯著關(guān)聯(lián)。
　　利用內(nèi)源安全標(biāo)記基因構(gòu)建無外源抗性標(biāo)記的球孢白僵菌工程菌株乳清酸核苷5一磷酸脫羧酶在細(xì)胞內(nèi)可催化尿苷（尿嘧啶）的合成，參與基因的翻譯而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。其基因ura3缺失致使細(xì)胞自身不能有效合成尿苷或尿嘧啶，因而無法正常生長(zhǎng)，但加入外源尿苷即可恢復(fù)生長(zhǎng)。利用這一特性，以球孢白僵菌ura3作為營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記取代原有的抗除草劑基因草丁膦抗性基因bar，