淡水育珠蚌硫氧還蛋白和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的分子克隆及表達(dá)分析.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)采用RACE PCR技術(shù)和巢氏PCR方法分別從褶紋冠蚌和三角帆蚌中克隆到硫氧還蛋白(Trx)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Grp78)基因的cDNA全長(zhǎng)序列。通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析了Trx在褶紋冠蚌血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、外套膜和肌肉組織中的表達(dá)，以及PBS刺激和金黃色葡萄球菌刺激后其在褶紋冠蚌五種組織中的表達(dá)變化。利用半定量RT-PCR分析Grp78基因在三角帆蚌的五個(gè)組織中表達(dá)，以及冷、熱休克誘導(dǎo)后Grp78基因在三角帆蚌的五個(gè)組織中

2、表達(dá)變化。
　　 1、CpTrx基因序列1169 bp（登錄號(hào):KC209545），其中5'非編碼區(qū)(UTR)長(zhǎng)11bp，3'非編碼區(qū)長(zhǎng)840 bp，含有PolyA尾和典型的腺苷酸信號(hào)序列AATAAA，開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）長(zhǎng)度為318 bp，編碼105個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為11.79 kDa，等電點(diǎn)為5.38，不含有信號(hào)肽。氨基酸序列中含有1個(gè)Thioredoxin結(jié)構(gòu)域(T3-K10

3、4)，區(qū)域內(nèi)包含一個(gè)保守的CGPC活化位點(diǎn)。序列同源性比較結(jié)果顯示褶紋冠蚌Trx與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)和紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)的氨基酸序列一致性分別為56％和52％。預(yù)測(cè)的Trx空間結(jié)構(gòu)由5個(gè)β折疊和4個(gè)α-螺旋組成，α-螺旋包圍β折疊形成緊密的球形，這一結(jié)構(gòu)與人的Trx空間結(jié)構(gòu)相似。Trx mRNA在血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、外套膜、閉殼肌中均有表達(dá)，在鰓中表達(dá)量最高，其次是

4、肝胰腺。金黃色葡萄球菌刺激褶紋冠蚌后，與PBS相比，各組織中的Trx表達(dá)量上升，血細(xì)胞中12h達(dá)到最高點(diǎn)后逐漸降低，48h最低但仍比空白對(duì)照高;肝胰臟中12h到48h一直升高到最大;鰓中12h明顯升高，并達(dá)到最大值，然后開始降低直至空白對(duì)照以下;外套膜中12h和24h的表達(dá)量逐漸降低，36h的表達(dá)量升高，達(dá)到最大值，48h的表達(dá)量再次降低至空白對(duì)照以下;閉殼肌中12h明顯升高，并達(dá)到最大值，24h、36h、48h的表達(dá)量明顯降低并至空白

5、對(duì)照以下。
　　 2、HcGrp78基因cDNA全長(zhǎng)為3721 bp，其中5'UTR長(zhǎng)度為148 bp，3'UTR長(zhǎng)度為1578 bp，包含1個(gè)AATAA加尾信號(hào)和一個(gè)多聚腺苷酸ploy(A)尾，開放閱讀框長(zhǎng)度為1995 bp，預(yù)測(cè)編碼664個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)HcGrp78蛋白分子量為73.27kDa，理論等電點(diǎn)為4.99。N端有一段長(zhǎng)度為22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽(Met-Gla22)。第44-51個(gè)氨基酸、第232-245個(gè)氨基酸及第

6、369-383個(gè)氨基酸為3個(gè)HSP70家族的簽名序列(Signature sequence)，分別為IDLGTTYS、VFDLGGGTFDVSLL和VVLVGGSTRIPKVQQ.含有16個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和、8個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。序列同源性比較結(jié)果顯示三角帆蚌Grp78與其他物種高度保守，同源性在92％以上。HcGrp78 mRNA在三角帆蚌肌肉、外套膜、鰓、肝胰腺和血細(xì)胞中均有表達(dá)。4℃冷刺激后，與正常溫度20