茶樹不同逆境條件下QRT-PCR適宜內(nèi)參基因的篩選.pdf

1、茶樹是我國重要的經(jīng)濟(jì)型作物，原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶，是一種喜暖喜濕的葉用木本植物。我國茶區(qū)分布較廣，地理范圍在18°～38°N，94°～122°E，氣候范圍南起熱帶季風(fēng)氣候北至暖溫帶季風(fēng)氣候;地形分布復(fù)雜，包括平原、丘陵、山地和高原。這些地區(qū)經(jīng)常出現(xiàn)季節(jié)性干旱、低溫和重金屬等引起的非生物逆境與病、蟲害引起的生物逆境，從而造成春茶產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降和上市時(shí)間推后等問題，嚴(yán)重影響了春季名優(yōu)茶的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益。僅靠栽培措施來解決茶樹逆境脅迫是不夠

2、的，抗逆育種已經(jīng)成為一種重要途徑?；诜肿铀缴系妮o助選擇正逐漸成為植物育種的有效工具，分離茶樹抗逆性基因，篩選到與抗逆性性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，就可以用于對茶樹品種的抗逆性狀進(jìn)行早期鑒定及抗逆性狀遺傳的穩(wěn)定性鑒定，這將大大縮短茶樹抗逆性育種的周期，降低選育難度。而在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行基因表達(dá)定量的方法，如實(shí)時(shí)定量PCR、RNA印跡、核糖核酸酶保護(hù)分析、基因芯片等，在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量的方法如蛋白質(zhì)印跡等，都需要應(yīng)用內(nèi)參基因(referenc

3、e gene)對目標(biāo)基因表達(dá)量進(jìn)行校正，以期獲得真實(shí)可靠的結(jié)果。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用同源克隆的方法克隆了茶樹相關(guān)內(nèi)參基因的部分片段，使用QRT-PCR的技術(shù)建立各基因?qū)?yīng)的實(shí)時(shí)定量方法，并進(jìn)一步研究了干旱、鋁、冷、鹽、傷害等不同逆境處理下相關(guān)內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性。具體研究結(jié)果如下:
　　 (1)利用同源克隆原理，以茶樹葉片cDNA為模板，獲得了7條內(nèi)參基因（GAPDH、EF-1α、18S rRNA、TUA1、TUA2、AC

4、T、UBI）的中間片段，經(jīng)BLAST可知這7條基因與其他物種的同源基因具有高度相似性，堿基相似性均在80％以上，一方面說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果是準(zhǔn)確的，同時(shí)也證明了內(nèi)參基因的保守性，進(jìn)一步驗(yàn)證了其在分子生物學(xué)定量分析中的應(yīng)用前景。
　　 (2)利用QRT-PCR技術(shù)，建立了7條基因?qū)?yīng)的實(shí)時(shí)定量實(shí)驗(yàn)方法。以10倍稀釋提純質(zhì)粒為模板，所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很高的敏感性及相關(guān)性，并且能在高通量范圍內(nèi)顯示cDNA樣品的起始量。
　　 (3)

5、以不同脅迫處理下的定量cDNA為模板，利用QRT-PCR技術(shù)，對前章實(shí)驗(yàn)中所得的7條內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。經(jīng)geNorm、BestKeeper及NormFinder三個(gè)生物學(xué)軟件計(jì)算得出結(jié)論，不同處理?xiàng)l件下，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性也不相同。結(jié)果表明在鋁脅迫處理?xiàng)l件下，18S rRNA表現(xiàn)出了相對最為穩(wěn)定的表達(dá)水平;冷脅迫下GAPDH與EF-1α都可應(yīng)用于相關(guān)實(shí)驗(yàn);傷害處理?xiàng)l件下則是TUA1及GAPDH為最佳內(nèi)參基因;干旱脅迫處理的最佳