山茶花MADS-box家族A類和C類基因克隆及功能分析.pdf

1、山茶花（Camellia japonica）是山茶屬（Camellia）的模式植物，該物種的許多品種花器官變異極其豐富，是我國傳統(tǒng)的十大名花之一。同時該物種還存在非常普遍的萼片瓣化和雄蕊瓣化的表型變異，這對于研究山茶花重瓣花形成的分子機理和起源方式均具有重要意義。分子植物育種可以縮短觀賞植物育種的周期，人為定向進行新品種培育。根據(jù)花器官發(fā)育的“ABC”模型，A類和C類功能基因可在植物山茶重瓣花形成中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。研究A類和C類基因在

2、山茶重瓣花形成中的分子調(diào)控機理，將為山茶和其他觀賞植物的花型育種提供依據(jù)。
　　 采用同源克隆方法和RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術(shù)，從山茶托桂型重瓣類栽培品種‘金盤荔枝'的發(fā)育早期花芽中分離到了山茶花花器官發(fā)育同源基因cDNA全長，序列分析表明分別為A類的AP1同源基因CjAPL1(GenBank登錄號JX657332)和CjAPL2(GenBank登錄號JX843815)、AG

3、L6同源基因CjAGL6（GenBank登錄號JX657333），C類的AG類同源基因jAG1(GenBank登錄號JX843816)。生物信息學(xué)和保守域分析表明，克隆的4個基因皆為典型的TypeⅡ類型的MADS-box家族花器官發(fā)育調(diào)控基因。
　　 以六種典型花型的山茶原種和品種為材料，利用實時熒光定量方法對山茶中獲得的4個基因的時空表達模式進行了研究。在時間表達模式中，隨著花芽發(fā)育成熟度的增加和花瓣數(shù)量的增多，CjAPL1和

4、CjAPL2基因的高表達趨勢表現(xiàn)為由花芽發(fā)育早期轉(zhuǎn)至中期，但在半重瓣品種的花芽發(fā)育中后期也進行了高表達。CjAGL6基因在單瓣花型中的最高表達量是在花芽發(fā)育早期，隨花瓣數(shù)量增多高表達轉(zhuǎn)至發(fā)育中后期，但半重瓣品種的后期表達量最高。CjAG1基因除在半重瓣品種的花芽發(fā)育中期進行了高表達外，在其他5種花型中普遍為花芽發(fā)育的后期表達量最高。
　　 在不同品種的山茶花器官中，CjAPL1基因在萼片或瓣化萼片、外輪花瓣中的表達量高于雄蕊和內(nèi)

5、輪花瓣，同時也在花柱、子房和瓣化雄蕊中存在高表達，表明CjAPL1基因不僅對萼片和外輪花瓣花器官調(diào)控功能比較明顯，而且對于花柱和子房也具有明顯的調(diào)控功能。CjAPL2基因與CjAPL1基因的表達模式相似，在山茶萼片、瓣化萼片、外輪花瓣和心皮中的表達量普遍高于內(nèi)輪花瓣和雄蕊，且在玫瑰重瓣型和完全重瓣型中該基因調(diào)控效果更加顯著。
　　 CjAGL6基因在單瓣型、半重瓣型和托桂型中的高表達集中于心皮、萼片或瓣化萼片部位，其次為內(nèi)輪的花

6、瓣、瓣化雄蕊和雄蕊;在其他3個品種中的高表達量部位為雄蕊和內(nèi)輪花瓣。
　　 CjAG1基因的表達量較一致，主要集中于心皮、雄蕊、瓣化雄蕊，且在內(nèi)輪花瓣和瓣化萼片中的總體表達量高于外輪花瓣;這說明CjAG1主要對內(nèi)輪花器官起調(diào)控作用。但在‘紅十八學(xué)士’中該基因?qū)τ趯τ谕廨喕ò旰桶昊嗥恼{(diào)控作用卻較內(nèi)輪花瓣明顯，顯示出山茶完全重瓣品種基因表達的特異性。
　　 利用酶切方法，分別構(gòu)建了4個正義植物表達載體和4個于擾植物表達載

7、體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法分別轉(zhuǎn)化擬南芥野生型、ap1-3和ag-1突變體植株。經(jīng)表型觀察統(tǒng)計，獲得了含CjAPL1、CjAPL2、CjAGL6和CjAG1正義基因的擬南芥野生型陽性植株分別為65株、42株、73株和102株;含CjAPL1、CjAGL6和CjAG1干擾基因的擬南芥陽性植株數(shù)量各45株、21株和25株:含CjAPL1正義基因的擬南芥ap1-3突變體和含CjAG1正義基因的擬南芥ag-1突變體陽性植株分別為36株和28

8、株。從每個轉(zhuǎn)基因表型為陽性類型的植株中隨機挑選3株，經(jīng)基因組PCR擴增和Southern雜交鑒定確認為陽性轉(zhuǎn)基因植株，熒光定量結(jié)果表明，與對照相比較，所有目的基因在轉(zhuǎn)正義和干擾基因的陽性植株中分別出現(xiàn)相應(yīng)表達量顯著升高和下降的結(jié)果。
　　 經(jīng)表型觀察統(tǒng)計，轉(zhuǎn)CjAPL1和CjAPL2基因擬南芥野生型植株典型的表型變異為:萼片邊緣演變?yōu)榛ò曩|(zhì)地的白色，花內(nèi)都出現(xiàn)花柱增加1枚，但雄蕊數(shù)量前者增加4枚，后者2-3枚;此外，轉(zhuǎn)CjAPL

9、2的植株單朵花花徑變大，花瓣增加i-3枚，萼片數(shù)量不變或減少1枚。CjAPL2還能夠促進花瓣形成，且這兩個基因還可以調(diào)控內(nèi)輪雌、雄蕊的器官數(shù)量增加。轉(zhuǎn)CjAGL6正義基因的植株雄蕊和雌蕊數(shù)量保持不變，但萼片增加1枚，花瓣數(shù)量和形態(tài)沒有發(fā)生變化。轉(zhuǎn)CjAG1正義基因的植株單朵花花徑縮小明顯，雄蕊增多2-4枚，萼片先端出現(xiàn)柱頭狀乳突，花瓣數(shù)量減少甚至無花瓣發(fā)育，雌蕊數(shù)量沒有變化。
　　 觀察到轉(zhuǎn)CjAPL1和CjAG1干擾基因的陽性

10、植株都出現(xiàn)雄蕊減少1-2枚的表型;轉(zhuǎn)CjAGL6干擾基因的花徑變大，雄蕊退化，花柱為1枚且上部分彎曲，萼片和花瓣各發(fā)育為3枚、內(nèi)彎，花瓣外表面的上半部分顏色變紅，表明所干擾的基因有調(diào)控萼片、花瓣和花柱生長及伸長的功能;雄蕊退化也表明CjAGL6對于花器官的形態(tài)和數(shù)量發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。
　　 在正義表達載體轉(zhuǎn)擬南芥突變體實驗中，轉(zhuǎn)山茶CjAPL1正義基因的擬南芥ap1-3突變體，花序恢復(fù)為總狀花序，單花花徑變大，花瓣數(shù)量也恢

11、復(fù)為4枚;同時，株型也得到恢復(fù)。通過轉(zhuǎn)擬南芥ap1-3突變體的花瓣數(shù)量增加，再次表明CjAPL1基因有增加花瓣數(shù)量的調(diào)控功能。轉(zhuǎn)山茶CjAG1正義基因的擬南芥ag-1突變體，雄蕊數(shù)量也恢復(fù)為6枚，這也證實了CjAG1基因具有調(diào)控雄蕊數(shù)量增加的功能。
　　 綜合熒光定量、模式植物功能驗證和表型觀察統(tǒng)計分析結(jié)果，認為山茶重瓣花的起源方式可能包括萼片起源、雄蕊起源和重復(fù)起源等多種，且這些起源方式對于不同花型重瓣花形成的作用是不同的。半

12、重瓣型品種的重瓣性為單一的萼片起源;牡丹重瓣型品種重瓣性為雄蕊起源為主，雄蕊起源和萼片起源并存;托桂型品種中重復(fù)起源與雄蕊起源并存，輔以萼片起源。玫瑰重瓣型和完全重瓣型山茶品種重瓣性以重復(fù)起源作為主要的重瓣花起源方式，輔以雄蕊起源和萼片起源。
　　 本研究表明，山茶CjAPL1、CjAPL2基因不僅能促進萼片向花瓣屬性的轉(zhuǎn)化，而且可以調(diào)控花瓣和雄蕊、雌蕊的數(shù)量增加;CjAGL6基因能夠調(diào)控雄蕊數(shù)量，同時促進增萼片和花瓣數(shù)量增多;