香蕉MADS-box基因的克隆、表達及與乙烯生物合成和信號轉導的關系研究.pdf

1、香蕉是世界上最重要的水果之一，被聯(lián)合國糧農組織定為世界第四大糧食作物。香蕉果實的采后成熟過程關系著香蕉的品質和貨槳期的長短，香蕉品質和貨架期又直接影響到香蕉產業(yè)的發(fā)展。因此研究香蕉采后成熟過程及調控對于香蕉品質形成和發(fā)展改良創(chuàng)新采后保鮮和催熟技術具有重要意義. 通過對乙烯生物合成速率的測定發(fā)現(xiàn)，香蕉采后的不同時期內，乙烯的生物合成速率會發(fā)生一系列的變化。根據(jù)文獻報道，從香蕉果實中克隆了香蕉采后果實成熟過程中乙烯生物合成的兩個關鍵

2、酶基因：Ma-ACO1(登陸號AJ223232)和Ma-ACS1(登陸號AB021906)。選取正常成熟和乙烯誘導成熟兩種處理條件下處于不同成熟階段的香蕉果實，提取總RNA，采用熒光定量PCR的方法對Ma-ACO1和Ma-ACS1的表達量的變化進行了研究，結合成熟乙烯生物合成的結果表明：Ma-ACS1直到系統(tǒng)2乙烯大量產生時表達量才顯著升高，是啟動乙烯生物合成的關鍵酶，而Ma-ACO1在系統(tǒng)1基礎水平的乙烯生物合成中起作用并于乙烯峰時表

3、達量迅速提高。 乙烯作為植物激素發(fā)揮其調控生長發(fā)育的作用要通過乙烯信號轉導過程，其第一步就是乙烯與乙烯受體的結合。本研究首次利用熒光定量PCR方法，對香蕉中乙烯受體基因Ma-ETR(登陸號AF113748)在正常成熟和乙烯誘導成熟果實中的表達量的變化進行研究，結果表明，Ma-ETR基因表達變化可能受乙烯生物合成速率調節(jié)，而且推測其也受外源乙烯的誘導。 為在分子水平上深入了解香蕉果實采后成熟的機理，分離香蕉果實采后差異表達

4、基因就成為一種有效的手段。我們通過抑制縮減雜交和cDNA微陣列相結合的方法分離獲得了在香蕉成熟早期上調的一個MADS-box基因的cDNA片段。在此基礎上從香蕉果實cDNA文庫中，采用RT-PCR技術分離獲得一個全長cDNA，經(jīng)序列測定和同源性分析表明，該cDNA含705bp的完整的開放閱讀框，編碼234個氨基酸殘基的MADS-box蛋白，由于其是第二個從香蕉中克隆到的MADS-box基因，因此將其命名為MuMADS2(MusaMADS

5、-box2)。MuMADS2全長1169bp，具有植物MADS-box基因家族中特有的M、I、K和C四個結構域，與蘆筍、風信子、蝴蝶蘭和百合的MADS-box基因的氨基酸序列存在很高的一致性(82％，78％，77％和75％)。將MuMADS2與其它植物來源的MADS-box基因進行序列比較發(fā)現(xiàn)，MuMADS2屬于植物MADS-box基因的AGAMOUS亞族的D世系。 采用RT-PCR的方法對其在香蕉各器官的表達情況進行分析表明，

6、MuMADS2僅在生殖器官(花和果)中表達，在營養(yǎng)器官(根、莖和葉)中不表達。而且在生殖器官中也具有組織特異性，即MuMADS2僅在雄花和雌花的子房、由雌花發(fā)育而成的果實中表達，而在雄花和雌花的柱頭和花柱都不表達。據(jù)此推測MuMADS2可能在果實的生長和發(fā)育過程中起作用。 同樣采用熒光定量PCR的方法研究MuMADS2在正常成熟和乙烯誘導成熟的香蕉果實采后不同成熟階段的表達情況。結果表明，在正常成熟的果實中，MuMADS2的表達

7、量在采后6d就達到了峰值，比成熟乙烯生物合成啟動的時間提前了4天。隨后下降，到采后14d，乙烯生物合成達到最高值時，MuMADS2又有小幅的上升，隨之又急劇下降。這說明很可能是MuMADS2表達量的升高誘導了成熟乙烯的生物合成。在乙烯誘導成熟的果實中，MuMADS2的表達量的升高發(fā)生在采后2d的果實中，而此時成熟乙烯的生物合成開始啟動。隨后迅速下降，而當成熟乙烯達到最大值時(8d)，MuMADS2的表達量也達到了最大值。這說明，在乙烯誘

8、導成熟的果實中，MuMADS2表達量的變化可能受到乙烯的誘導而呈現(xiàn)出與正常成熟果實中所不同的表達方式，但MuMADS2表達的峰值在兩種處理條件下相差不大。 轉基因技術是目前進行基因功能驗證的有效手段，以pCAMBIA1302載體為基礎，將MuMADS2成功插入到35s啟動子下游，GFP基因上游，構建好的植物表達載體命名為pCAMBIA1302-MuMADS2，為后續(xù)的轉基因驗證功能工作奠定了基礎。 為研究MuMADS2的