六種重要瓜類種傳細(xì)菌可視基因芯片篩查及瓜類果斑病菌交叉引物擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、瓜類作物在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位。種傳細(xì)菌是瓜類作物及健康種子生產(chǎn)中關(guān)注的重要對(duì)象，如西瓜嗜酸菌引起的瓜類果斑病，就是嚴(yán)重危害葫蘆科作物的國際性檢疫類病害，可在西瓜種植區(qū)造成大規(guī)模的經(jīng)濟(jì)損失。目前除瓜類果斑病菌外，其他瓜類種傳細(xì)菌病害還沒有快速可行的檢測(cè)方法，亦無檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重影響了口岸檢疫和疫情診斷的速度與效率。因此針對(duì)瓜類種傳細(xì)菌病害建立快速靈敏且能同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)病菌的檢測(cè)技術(shù)顯得尤為迫切。本論文分別以可視基因芯片和交叉

2、引物擴(kuò)增（cross-priming amplification，CPA）兩項(xiàng)技術(shù)為平臺(tái)，對(duì)重要瓜類種傳細(xì)菌病害的病原物進(jìn)行新型檢測(cè)方法的研究。依靠這兩種新型分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立的篩查、檢測(cè)方法，可以為瓜類種傳細(xì)菌的快速初篩及健康種子質(zhì)量控制提供新手段。
　　 本文針對(duì)細(xì)菌性白枯病菌（Pseudomonas viridiflava，Pv）、細(xì)菌性角斑病菌(P.syringae pv.lachrymans，Psl)、丁香假單胞丁

3、香致病變種(P.syringae pv.syringae，Pss)、瓜類果斑病菌（Acidovorax citrulli，Ac）、細(xì)菌性葉斑病菌(Xanthomonascucurbitae，Xc)、甜瓜黃單胞菌(X.melonis，Xm)六種瓜類種傳細(xì)菌，利用多重PCR擴(kuò)增及可視芯片檢測(cè)技術(shù)，建立了可視基因芯片篩查方法。本研究應(yīng)用三對(duì)基于細(xì)菌DNA gyrase subunit B genes（gyrB）基因設(shè)計(jì)的屬內(nèi)通用引物，建立了擴(kuò)

4、增效率良好的多重PCR檢測(cè)體系。芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，以細(xì)菌純培養(yǎng)液為模板，六種目標(biāo)菌檢測(cè)靈敏度分別為，Pv:4.0×104CFU/mL; Psl:1.0×103 CFU/mL; Pss:2.0×103CFU/mL; Ac:4.5×103CFU/mL;Xm:3.0×104CFU/mL; Xc:2.0×104 CFU/mL。該結(jié)果比傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測(cè)普遍提高10倍。實(shí)驗(yàn)還對(duì)新方法在種子樣品實(shí)體檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示可以從人工模擬

5、帶菌的西瓜、甜瓜、黃瓜的種子樣品及自然感染瓜類果斑病菌的西瓜種子上檢測(cè)到目標(biāo)細(xì)菌。在對(duì)29株來自不同種屬的非目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行的特異性測(cè)試中，雖有8株細(xì)菌發(fā)生假陽性顯色，但因其不是瓜類作物的致病菌，由此判斷，在對(duì)瓜種進(jìn)行檢測(cè)的過程當(dāng)中因以上非特異菌株導(dǎo)致結(jié)果呈陽性的可能性很小。與傳統(tǒng)的凝膠電泳法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相比，本研究建立的可視基因芯片檢測(cè)法可以排除因擴(kuò)增片段大小相似而導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，具有高效、實(shí)用、高通量以及無需信號(hào)分析處理裝置等優(yōu)

6、點(diǎn)，可以作為瓜類種傳細(xì)菌病害的初篩手段進(jìn)行應(yīng)用。
　　 研究內(nèi)容的第二部分介紹了瓜類果斑病菌交叉引物擴(kuò)增檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用。通過結(jié)合應(yīng)用交叉引物擴(kuò)增技術(shù)和膠體金檢測(cè)試紙條，建立了一種具有快速方便、靈敏特異、不需昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)的瓜類果斑病新型檢測(cè)方法，能夠高效地對(duì)葫蘆科作物的帶菌情況進(jìn)行檢測(cè)。DNA序列經(jīng)過在恒溫條件下特異性擴(kuò)增后，便能夠在一次性全封閉式靶核酸擴(kuò)增物檢測(cè)裝置上直接觀察到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，整套操作過程只需提供離心機(jī)和簡

7、單的恒溫設(shè)備。本研究在A.citrulli的16S rDNA序列區(qū)段設(shè)計(jì)了三條引物及兩條探針。在針對(duì)菌懸液進(jìn)行的靈敏度定量分析中，檢測(cè)水平為3.7×103 CFU/mL。在帶菌種子的實(shí)體檢測(cè)中，分別以人工模擬帶菌和天然帶菌的西瓜種子浸泡液中提取得到的DNA為模板，成功檢測(cè)出瓜類果斑病菌，并且證實(shí)了種子樣品檢測(cè)的靈敏度為1.8×103 CFU。本研究所建立的瓜類果斑病新型檢測(cè)方法，將會(huì)有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)PCR、熒光定量PCR等技術(shù)在儀器不完善、