低氧-低硒對肉雞肺臟內(nèi)皮素-1和其受體基因表達(dá)的影響.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(Pulmonaryhypertension，PH)及伴隨而來的肺血管重構(gòu)(Pulmonaryvascularremolding，PVR)和腹水(Ascites，As)是商品化肉雞生產(chǎn)中常見的營養(yǎng)代謝病。目前認(rèn)為缺氧性PH是肉雞As病理機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。各種導(dǎo)致機(jī)體缺氧的因素使機(jī)體處于氧饑餓狀態(tài)，促使心臟輸出量上升，心臟和肺臟功能隨之增強(qiáng)，肺動(dòng)脈壓升高。肺動(dòng)脈壓升高首先引起右心功能出現(xiàn)機(jī)能性代償，持續(xù)的PH引起心肺系統(tǒng)機(jī)能代償和

2、結(jié)構(gòu)代償并存，進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致兩種代償相繼失調(diào)，出現(xiàn)右心肥大衰竭和以肺小動(dòng)脈平滑肌中膜增厚、管腔變窄及非肌型動(dòng)脈肌化為特征的PVR，致使肺動(dòng)脈痙攣、肺循環(huán)壓力升高、肺血管的順應(yīng)性降低，最終導(dǎo)致As的發(fā)生。
　　內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)是一種具有多種生物活性的多肽，為目前已知的動(dòng)物機(jī)體內(nèi)生物學(xué)活性最強(qiáng)、作用時(shí)間最長的血管收縮物質(zhì)，其擁有強(qiáng)大的收縮血管及誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞分裂增殖的活性，在心血管和呼呼系統(tǒng)疾病的發(fā)

3、生發(fā)展進(jìn)程中起到重要作用。ET-1生物學(xué)功能的發(fā)揮是通過與其受體A(ETA)和受體B(ETB)結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。在肺血管系統(tǒng)中，ETA主要分布于血管平滑肌細(xì)胞，與ET-1結(jié)合后介導(dǎo)肺血管的收縮;ETB集中存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，與ET-1結(jié)合后誘導(dǎo)血管舒張，同時(shí)ETB可以抑制ET-1的釋放，并抗衡其生物學(xué)效應(yīng)，從而參與肺血管短時(shí)張力調(diào)節(jié)。
　　哺乳動(dòng)物模型和人醫(yī)臨床均已證實(shí)ET-1及其受體表達(dá)異常與PH和PVR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明

4、，PH小鼠血漿ET-1的水平明顯升高，同時(shí)其肺組織中ET-1的表達(dá)也增加。用放射免疫和原位雜交的方法，證實(shí)ET-1mRNA的表達(dá)量在缺氧大鼠肺組織中顯著增加，且與肺動(dòng)脈壓力的升高呈正相關(guān)。國外臨床資料顯示，PH患者肺循環(huán)中ET-1含量增多，血漿ET-1水平明顯上升，其升高程度與PH呈正相關(guān)。在一些經(jīng)過常規(guī)治療PH患者，其血漿ET-1水平與生存率呈負(fù)相關(guān)，給予ET-1拮抗劑可顯著促進(jìn)PH患者肺臟ET-1的清除和釋放，提高PH患者的生存率。

5、由此可見，ET-1和其受體在PH病理生理進(jìn)程中扮演重要角色。
　　然而，以上研究多是在器官水平上進(jìn)行探討，并且有關(guān)肉雞PH和PVR過程中ET-1及其受體基因動(dòng)態(tài)表達(dá)情況鮮見報(bào)道。基于以上背景，我們試圖從動(dòng)物水平、細(xì)胞、分子和蛋白水平上就低氧/低硒誘導(dǎo)的肉雞肺臟、肺血管細(xì)胞（肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）ET-1及其受體基因動(dòng)態(tài)表達(dá)變化進(jìn)行系統(tǒng)、深入探究。
　　1.高原低氧對肉雞PH及其肺臟ET-1、ETA和ETB表達(dá)的

6、影響
　　本試驗(yàn)利用西藏高原天然低氧環(huán)境，采用動(dòng)物試驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)等方法，探討高原低氧環(huán)境對肉雞PH和PVR病理過程中ET-1、ETA和ETB基因表達(dá)的影響。600只1日齡愛拔益加肉仔雞隨機(jī)分為兩組:增氧對照組，肉仔雞飼養(yǎng)于正常氧氣濃度環(huán)境下，空氣中氧氣含量為21％左右;高原低氧組，肉仔雞暴露于高原低氧環(huán)境下，空氣中氧氣含量為17％左右。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與增氧對照組相比，暴露在高原低氧環(huán)境下21d和28d的肉雞肺臟ET-1(P＜

7、0.05，P＜0.05)和ETA(P＜0.01，P＜0.01)基因表達(dá)水平明顯升高;ETBmRNA表達(dá)量在高原低氧環(huán)境下處理21d顯著上升(P＜0.05)，28dETBmRNA表達(dá)水平又出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05)。此外，試驗(yàn)結(jié)果表明，處于高原低氧環(huán)境下肉雞的生長發(fā)育受到明顯抑制，表現(xiàn)在周增重的顯著下降(P＜0.05);同時(shí)，低氧環(huán)境下肉雞的As發(fā)病率也大幅上升(P＜0.05)，低氧處理時(shí)間與As發(fā)病率呈現(xiàn)出強(qiáng)烈正相關(guān)。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果提示

8、，高原低氧環(huán)境下肉雞肺臟ET-1、ETA基因表達(dá)水平升高與ETBmRNA表達(dá)量先上升后下降的變化可能與肉雞肺臟功能障礙如PH、As和PVR在病理進(jìn)程中密切相關(guān)。
　　2.肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　本試驗(yàn)應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法，選用18-19d愛拔益加肉雞雞胚，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌分離培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)，結(jié)合體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行綜合鑒定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，肺動(dòng)脈組織塊在培養(yǎng)4

9、8h即有少量細(xì)胞長出，72h后細(xì)胞大量生長增殖。培養(yǎng)細(xì)胞形狀多為長梭形或三角形，大小均勻，待培養(yǎng)細(xì)胞生長融合成單層后呈漩渦狀或放射狀，局部細(xì)胞多層重疊生長，此起彼伏，展現(xiàn)出平滑肌細(xì)胞特有的“峰-谷”樣外觀。α-SMA細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定結(jié)果顯示，培養(yǎng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)有明顯棕色沉淀，高倍鏡下可見胞漿內(nèi)有細(xì)絲;而陰性對照組細(xì)胞胞漿內(nèi)無明顯棕色沉淀。該培養(yǎng)方法對儀器設(shè)備要求不高，操作簡便易行，能在短時(shí)間內(nèi)且穩(wěn)定地培養(yǎng)出PASMCs，為肉雞PH、As和

10、PVR等疾病在細(xì)胞水平上深入研究提供體外模型。
　　3.肉雞肺臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　本試驗(yàn)應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法，選用16-17d愛拔益加肉雞雞胚，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌分離培養(yǎng)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs)，結(jié)合體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)等方法對細(xì)胞進(jìn)行綜合鑒定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24h后肺臟組織塊周圍有少量細(xì)胞長出，48h后細(xì)胞快速大量增殖。培養(yǎng)細(xì)胞形狀以梭形或多邊形居多，細(xì)胞形態(tài)飽滿，大小均勻，排列緊密，細(xì)

11、胞生長融合成單層后呈現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特有的鵝卵石外觀。異植物血凝素(FITC-BSI)結(jié)合試驗(yàn)、CD31單抗和Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫化學(xué)結(jié)果均呈陽性反應(yīng)，表明分離培養(yǎng)細(xì)胞為肉雞PMVECs。本試驗(yàn)建立得培養(yǎng)法對儀器設(shè)備要求不高，操作簡便易行，能在較短時(shí)間內(nèi)且穩(wěn)定地培養(yǎng)出PMVECs，為肉雞PH、As和PVR等疾病在細(xì)胞水平上深入研究提供體外模型。
　　4.低氧處理對肉雞PASMCsET-1、ETA和ETB基因表達(dá)的影響
　　PASM

12、Cs的異常增殖是PH、As和PVR的病理學(xué)基礎(chǔ)，而ET-1具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞分裂增殖的能力。本試驗(yàn)應(yīng)用qRT-PCR和Westernblot等技術(shù)手段觀察低氧條件下肉雞PASMCsET-1、ETA、ETBmRNA和蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)，探討ET系統(tǒng)在低氧處理的肉雞PASMCs中的表達(dá)變化對PH、As和PVR等病理過程的影響。肉雞PASMCs在常氧(21％O2)和低氧(1％O2)條件下分別處理6h、12h、24h、48h。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與

13、正常氧對照組相比，肉雞PASMCs低氧處理24h和48hET-1mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05，P＜0.01);ETAmRNA和蛋白表達(dá)水平在低氧處理12h、24h和48h出現(xiàn)上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）;ETBmRNA和蛋白表達(dá)水平在低氧處理6h和12h后出現(xiàn)上調(diào)(P＜0.05，P＜0.01)，48h后ETB基因表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05)。本研究試驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，低氧條件下肉雞PASMCsET-1

14、和ETA基因表達(dá)水平上升與ETB基因表達(dá)先上升后下降的變化可能與肉雞PH、As和PVR病理過程緊密相關(guān)。
　　5.紅景天苷對低氧處理的肉雞PASMCsET-1、ETA和ETB基因表達(dá)的影響
　　PH是一種以肺血管細(xì)胞異常增殖和重構(gòu)為特征的、對人和動(dòng)物危害嚴(yán)重的慢性心血管疾病之一。研究已證實(shí)，在人和動(dòng)物疾病模型中，ET-1與PVR在病理進(jìn)程中存在密切和（或）因果聯(lián)系。紅景天苷(SDS)，一種傳統(tǒng)藏藥，為紅景天根的主要活性成分，

15、具有多種藥理學(xué)特性，包括抗缺氧、抗疲勞、提高適應(yīng)力等，在西藏尤其以作為抗高原反應(yīng)藥而出名。然而，目前關(guān)于SDS對暴露在低氧環(huán)境下肉雞PASMCsET-1、ETA和ETB基因表達(dá)的影響還不清楚。因此，本研究主要目的是評估SDS對低氧處理的肉雞PASMCsET-1、ETA和ETB基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以期為肉雞PH和PVR等疾病研究提供更多參考。肉雞PASMCs分為SDS處理組和空白對照組并各自預(yù)處理1h后，然后暴露在低氧條件下處理24h。應(yīng)

16、用qRT-PCR和Westernblot分析ET-1、ETA和ETB基因表達(dá)情況。與空白對照組相比，試驗(yàn)結(jié)果顯示，SDS在中濃度組(80μg/ml)和高濃度組(120μg/ml)能顯著下調(diào)低氧處理的PASMCsET-1基因表達(dá)水平(P＜0.01，P＜0.05)，但低濃度組對基因表達(dá)沒有明顯影響。同時(shí)，ETA基因表達(dá)量在三個(gè)SDS濃度組(40，80，120μg/ml)均呈下降趨勢（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。此外，試驗(yàn)結(jié)果

17、顯示，SDS(40，80μg/ml)也能明顯下調(diào)低氧處理的PASMCsETB基因表達(dá)水平(P＜0.01，P＜0.01)。本試驗(yàn)研究結(jié)果提示，SDS抗高原反應(yīng)作用可能是通過下調(diào)低氧條件下PASMCsET-1、ETA和ETB異常高表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，其可考慮作為預(yù)防和治療肉雞PH和PVR的備選藥物。
　　6.硒處理對肉雞PMVECsET-1、ETA和ETB基因表達(dá)的影響
　　本試驗(yàn)的主要目的是評估硒對肉雞PMVECsET-1、ETA和

18、ETB基因表達(dá)的影響。將PMVECs分別在硒缺乏和硒添加(12，24，50，100ng/ml)培養(yǎng)基中處理48h，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)來檢測硒對肉雞PMVECsET-1、ETA和ETB基因表達(dá)的影響。與對照組（硒缺乏組）相比，試驗(yàn)結(jié)果顯示，ET-1mRNA表達(dá)水平在中硒濃度組(24，50ng/ml，P＜0.01，P＜0.01)和高硒濃度組(100ng/ml，P＜0.05)顯著下降，但在低硒濃度組(12ng/ml)，ET-1mRNA表達(dá)

19、水平?jīng)]有明顯改變。同時(shí)，硒添加(24，50，100ng/ml，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05)可以有效下調(diào)低硒培養(yǎng)的PMVECsETAmRNA表達(dá)水平。然而，硒添加對ETBmRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。試驗(yàn)結(jié)果提示，硒在調(diào)節(jié)ET-1及其受體基因表達(dá)與產(chǎn)物合成過程中可能發(fā)揮直接或間接的作用。硒添加可以有效降低低硒培養(yǎng)的PMVECsET-1和ETA基因異常高表達(dá)，提示硒預(yù)防和治療肉雞As部分機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)ET-1及其受體基因表