不同啟動(dòng)子和插入位點(diǎn)表達(dá)AIV-H9 HA抗原的重組馬立克氏病病毒的構(gòu)建和比較研究.pdf

1、馬立克氏病病毒(Marek's Disease Virus，MDV) GX0101株是我們實(shí)驗(yàn)室在2001年從廣西某雞場(chǎng)中分離到一株帶有禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的1型MDV GX0101，其致病型為超強(qiáng)毒。將該毒株構(gòu)建成細(xì)菌人工染色體(BAC)克隆，并在此傳染性克隆的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一系列的研究。其中敲除了GX0101兩個(gè)致腫瘤基因Meq，構(gòu)建了Meq缺失株GX0101△Meq，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明該突變株不僅

2、失去了雞群的致病性和免疫抑制，而且還可以對(duì)雞群起到很好的保護(hù)性免疫作用，其保護(hù)效果要超過(guò)CVI988疫苗。本研究在GX0101△Meq的基礎(chǔ)上，將該突變株作為載體表達(dá)H9N2禽流感病毒的HA基因，構(gòu)建了不同的重組病毒并對(duì)這些重組病毒進(jìn)行了體外和體內(nèi)的研究。
　　1抗H9N2-HA鼠多克隆抗體的制備及H9N2-HA真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　本研究中構(gòu)建了9株以GX0101△Meq為載體表達(dá)H9N2-HA的重組病毒。為了驗(yàn)證重組病

3、毒中HA基因在體外的表達(dá)，首先制備了H9N2禽流感HA的鼠多克隆抗體，用于后續(xù)研究中HA基因在重組MDV表達(dá)的檢測(cè)。然后又構(gòu)建表達(dá)H9N2-HA的重組病毒，首先我們需要構(gòu)建能夠在真核系統(tǒng)中表達(dá)HA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。將整段HA基因的ORF克隆到以CMV為啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）中，并將該真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，以上述制備的HA抗體作為一抗用IFA驗(yàn)證真核表達(dá)質(zhì)粒中HA在CEF中的表達(dá)。結(jié)果顯示，IFA可以檢測(cè)到CE

4、F細(xì)胞中HA蛋白的存在，證明本研究中構(gòu)建的HA真核表達(dá)質(zhì)粒能夠成功表達(dá)HA基因，可以用于后續(xù)研究。
　　2應(yīng)用RedE/T重組系統(tǒng)和Flp/FRT重組系統(tǒng)以?xún)刹街亟M法構(gòu)建一株以GX0101△Meq為載體表達(dá)H9N2-HA基因的重組病毒rGX-CMV-HA
　　本部分研究主要解決構(gòu)建重組MDV的方法學(xué)問(wèn)題。我們的研究先后嘗試了不同方法用于構(gòu)建重組MDV，這些方法包括真核細(xì)胞上的同源重組、在BAC系統(tǒng)中的RedE/T重組（應(yīng)用C

5、ounter-Selection BAC Modification Kit試劑盒）、在BAC中利用RedE/T重組系統(tǒng)和Flp/FRT重組系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)近1年半的時(shí)間對(duì)構(gòu)建重組MDV的方法學(xué)的探索，我們建立一種非常方便的構(gòu)建重組MDV的方法。
　　首先在HA基因表達(dá)盒前引入Kanr抗性篩選基因，然后利用RedE/T重組系統(tǒng)在大腸桿菌EL250中將這段帶有抗性篩選基因的HA表達(dá)盒作為外源插入片段整合到GX0101△Meq載體質(zhì)粒上，再利

6、用Flp/FRT重組系統(tǒng)在L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)下將Kanr抗性篩選基因從重組子中敲除掉。將通過(guò)驗(yàn)證完全敲除了Kanr抗性篩選基因的重組質(zhì)粒prGX-CMV-HA從EL250大腸桿菌中提取出來(lái)，轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞拯救病毒，并通過(guò)IFA驗(yàn)證重組病毒中HA基因的表達(dá)。結(jié)果表明，通過(guò)這種兩步重組法，我們成功獲得了重組病毒rGX-CMV-HA，并且IFA驗(yàn)證HA基因在重組病毒感染的CEF中成功表達(dá)。
　　3以GX0101△Meq為載體的重組MDV

7、中不同啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄H9N2-HA基因的活性比較
　　為了研究不同的啟動(dòng)子在重組MDV中轉(zhuǎn)錄HA基因的活性，本研究中以GX0101△Meq為載體，利用前期探索的兩步重組法，在已經(jīng)構(gòu)建好的重組病毒rGX-CMV-HA的基礎(chǔ)上又構(gòu)建了4株不同的重組病毒。這些重組病毒分別用了5個(gè)不同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄HA基因，這5個(gè)啟動(dòng)子包含3個(gè)內(nèi)源啟動(dòng)子和2個(gè)外源啟動(dòng)子，內(nèi)源啟動(dòng)子是來(lái)自GX0101△Meq載體自身的gB基因啟動(dòng)子(gB)和另一個(gè)來(lái)自GX010

8、1△Meq載體自身的位于PP38和1.8kb RNA轉(zhuǎn)錄子之間的雙向啟動(dòng)子的兩個(gè)方向，即PP38方向(pPP38)和1.8kb RNA轉(zhuǎn)錄子方向(p1.8kb)。外源啟動(dòng)子分別為CMV啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子。我們對(duì)這5個(gè)不同的重組病毒進(jìn)行了體外和體內(nèi)的比較研究，結(jié)果顯示，在細(xì)胞培養(yǎng)中，重組病毒rGX-CMV-HA中HA基因轉(zhuǎn)錄水平最高， rGX-SV40-HA和rGX-p1.8kb-HA兩者轉(zhuǎn)錄外源基因的能力幾乎在同一水平，其他兩個(gè)內(nèi)源

9、啟動(dòng)子pPP38和gB在重組病毒中轉(zhuǎn)錄HA基因的水平較低，其中rGX-pPP38-HA處在最低的水平。雙向啟動(dòng)子的兩個(gè)方向pPP38和p1.8kb的轉(zhuǎn)錄水平差異較大，rGX-p1.8kb-HA的轉(zhuǎn)錄水平要明顯超過(guò)rGX-pPP38-HA轉(zhuǎn)錄HA的水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，5個(gè)重組病毒均可以在體內(nèi)復(fù)制，但均不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體，rGX-CMV-HA，rGX-SV40-HA，rGX-p1.8kb-HA均不能對(duì)雞群起到保護(hù)效果。而重組病毒rGX-g

10、B-HA的有25％的雞得到保護(hù)，重組病毒rGX-pPP38-HA可以給感染雞提供50％的保護(hù)。
　　4重組病毒中GX0101△Meq載體上的不同插入位點(diǎn)對(duì)表達(dá)HA外源基因的影響
　　為了研究GX0101△Meq載體上的不同插入位點(diǎn)對(duì)表達(dá)HA外源基因的影響，我們根據(jù)不同啟動(dòng)子在重組GX0101△Meq中轉(zhuǎn)錄HA基因活性大小的研究結(jié)果，選擇處于中等轉(zhuǎn)錄活性強(qiáng)度的雙向啟動(dòng)子的1.8kb轉(zhuǎn)錄子方向(p1.8kb)作為啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄HA基

11、因，同時(shí)選擇了GX0101△Meq載體上病毒復(fù)制非必須區(qū)US2、US10、Meq以及BAC骨架上的gpt基因位點(diǎn)作為靶位點(diǎn)，分別將HA表達(dá)盒整合到這些區(qū)域，將這些構(gòu)建的重組病毒rGX-US2-HA，rGX-US10-HA，rGX-Meq-HA和rGX-gpt-HA感染CEF細(xì)胞，利用ELISA和熒光定量RT-PCT分別研究這些病毒在細(xì)胞培養(yǎng)上表達(dá)HA蛋白水平和轉(zhuǎn)錄mRNA水平的差異。通過(guò)接種雞的實(shí)驗(yàn)研究這些不同重組病毒對(duì)雞群的保護(hù)效果。

12、結(jié)果顯示，在細(xì)胞培養(yǎng)上，在GX0101△Meq載體上的不同位點(diǎn)表達(dá)外源HA基因無(wú)論是在蛋白水平還是在mRNA水平上都有差異，在US2區(qū)表達(dá)外源基因的活性最強(qiáng)，其次是US10和Meq區(qū)，我們所選擇的外源插入gpt位點(diǎn)表達(dá)HA基因的能力最弱。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示，4株重組病毒均可以在體內(nèi)復(fù)制，但是都不能誘發(fā)可檢測(cè)到的血清中針對(duì)H9N2的抗體。重組病毒rGX-US2-HA、rGX-US10-HA和rGX-gpt-HA對(duì)SPF雞沒(méi)有任何保護(hù)效果，但