馬立克氏病毒SC9-2株生物學活性的比較研究及表達NDV-F基因重組病毒的構建.pdf

1、馬立克氏病（Marek’s disease，MD）是雞的一種高度接觸性腫瘤病，其主要特征是淋巴組織增生和腫瘤的形成。馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)包括三種血清型：血清1型（MDV-Ⅰ)屬于能引起腫瘤的MDV，血清2型（MDV-Ⅱ）屬于天然不致瘤的MDV，火雞皰疹病毒（HVT)屬于血清3型（MDV-Ⅲ）。2001年，本實驗室張志等從中國廣西省某雞場分離得到一株自然重組禽網狀內皮組織增生癥病毒（REV）

2、長末端重復序列（LTR）的1型MDV野毒株 GX0101。為了解GX0101的生物學活性，我們使用細菌人工染色體（BAC）技術構建了GX0101的BAC克隆BAC-GX0101，在BAC-GX0101的基礎上，敲除兩個致腫瘤的meq基因，同時誘導掉重組過程中插入的Kan+表達盒，得到了meq基因缺失株MDV GX0101?meq?Kan，即SC9-1株MDV。研究表明，SC9-1株不僅失去了1型MDV的致病性而且能夠提供比商品化CVI9

3、88/Rispens疫苗更好的免疫保護效果。在SC9-1的基礎之上，我們通過cre-loxp重組系統(tǒng)進一步敲除SC9-1中的BAC骨架得到SC9-2株MDV，本研究旨在比較不同代次SC9-2的生物學活性及以SC9-1為載體構建表達NDV-F基因的重組MDV。
　　1. SC9-1中細菌人工染色體（BAC）序列自我敲除的分子鑒定
　　為了對缺失meq基因的MDV SC9-1感染性克隆基因組中BAC的自我敲除進行分子鑒定。將含有

4、表達cre重組酶真核表達盒的SC9-1重組質粒通過轉染雞胚成纖維細胞（CEF）拯救SC9-1重組病毒。將SC9-1重組病毒在CEF細胞上進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，利用病毒表達的cre重組酶在傳代過程中逐步敲除病毒的BAC序列。分別提取1~10代不同代次SC9-1重組病毒的DNA作為模板，利用BAC序列特異性引物對病毒基因組中的BAC進行PCR檢測。同時利用針對BAC序列gpt基因的特異性檢測引物，以MDV保守基因pp38作為內參，對不同代次病毒

5、基因組中BAC序列進行熒光定量PCR的檢測。利用PCR擴增SC9-1病毒敲除BAC序列后基因組中殘留loxp位點兩端序列，通過測序分析進一步驗證BAC序列的敲除。利用BAC序列特異性引物對不同代次病毒基因組中BAC序列的檢測結果顯示：1~5代的病毒DNA均能擴增出600 bp的特異性目的條帶，證實病毒的基因組中含有BAC序列。6~10代病毒DNA均不能擴增出特異性目的條帶，證實病毒的基因組中沒有BAC序列。熒光定量PCR的結果顯示，病毒

6、基因組中的BAC序列隨著病毒的傳代逐漸減少，直至第6代已經完全檢測不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的過程中，對每代病毒BAC序列敲除后殘留loxp位點序列進行PCR測序鑒定，結果顯示BAC序列敲除后基因組中僅留下一個loxp位點，序列同源性均在99.7％以上。結果表明，利用cre-loxp系統(tǒng)將病毒在CEF細胞上連續(xù)6代傳代培養(yǎng)可將SC9-1中的BAC序列完全敲除掉，且同源重組酶敲除BAC序列具有高度的一致性。
　　2.馬立克

7、氏病病毒疫苗株SC9-2在CEF細胞上的傳代致弱及其免疫抑制作用和保護效果的評估
　　MD是由α-皰疹病毒MDV引起的雞的一種淋巴組織增生性疾病。之前的研究表明，敲除meq基因的超強MDV（vv MDV）能夠提供比商品化CVI988/Rispens更好的免疫保護，而且在鴨胚成纖維細胞(DEV)連續(xù)傳40代后能夠消除病毒在母源抗體陰性雞中引起的免疫器官（胸腺和法氏囊）萎縮以及體重的減輕。本研究中，我們將meq基因敲除株SC9-2株M

8、DV在雞胚成纖維細胞（CEF）上連續(xù)傳代。結果表明，接種40代SC9-2（SC9-2/40th）的SPF雞的體重及胸腺和法氏囊相對于體重的指數(shù)要高于免疫10代SC9-2（SC9-2/10th）的SPF雞，但都顯著低于空白對照組。SC9-2/40th和SC9-2/10th對于禽流感（AIV）和新城疫（NDV）滅活苗產生的抗體水平差異不顯著，但都低于空白對照組，而且存在顯著差異。接種SC9-2/40th的SPF雞在羽毛囊中的病毒載量要低于S

9、C9-2/10th的病毒載量，但是免疫保護效果沒有差異，同時免疫保護指數(shù)明顯好于CVI988/Rispens。所有結果表明，SC9-2/40th的免疫抑制顯著降低，但仍需要繼續(xù)傳代減弱免疫抑制。本研究為細胞傳代致弱缺失meq基因的超強MDV提供了依據。
　　3.表達NDV-F基因重組MDV的構建及其在雞體內外的復制
　　以敲除meq基因的MDV-Ⅰ型弱毒SC9-1（GX0101?meq?Kan）為載體構建一株表達外源基因ND

10、V-F的重組病毒。將外源基因NDV-F的ORF插入到真核表達載體pcDNA3.1（-）中，擴增含有CMV啟動子的NDV-F表達盒，同時擴增篩選基因Kan+表達盒，將他們插入到載體pMD18-T中。用含有MDV-US2區(qū)50 bp同源臂的引物擴增串聯(lián)表達盒，將產物電轉進含有SC9-1的EL250宿主菌中，1%阿拉伯糖誘導掉陽性重組病毒基因組中的Kan+表達盒。挑選敲除Kan+表達盒的陽性克隆提取質粒，轉染CEF細胞拯救重組病毒。將重組病毒