家蠶伴性赤蟻(sch)高溫致死機(jī)理研究.pdf

1、家蠶伴性赤蟻（sex-linked chocolate，sch）是赤蟻突變品種之一，其性狀表現(xiàn)為蟻蠶體色和頭部呈現(xiàn)紅棕色，而蛻皮后體色與正常無(wú)明顯區(qū)別。該性狀為單一基因控制的隱性性狀，位于家蠶性染色Z上的21.5座位;同時(shí)伴性赤蟻胚胎后期具有溫敏致死性，因此，家蠶育種學(xué)家利用這兩個(gè)特性將sch培育成了單養(yǎng)雄蠶的生產(chǎn)品種。單養(yǎng)雄蠶可以大大降低生產(chǎn)成本，同時(shí)可以獲得更加優(yōu)質(zhì)的蠶絲，生產(chǎn)高品質(zhì)蠶絲制品。前期研究已經(jīng)克隆了sch的體色突變基因B

2、mTh，該基因與溫敏致死的關(guān)系目前還不是很明確，因此，本研究對(duì)伴性赤蟻的溫敏致死機(jī)理開(kāi)展了以下的研究，并獲得了相應(yīng)的結(jié)果:
　　1、家蠶伴性赤蟻胚胎期溫敏致死性狀調(diào)查
　　本研究從Dz和sch胚胎發(fā)育第五天至第八天每天都進(jìn)行不同溫度（25℃、30℃和35℃）和不同時(shí)間(1h、3h、16h、24 h、36h、50h)的處理，處理完成后將蠶卵放入25℃中正常催青待孵化后統(tǒng)計(jì)孵化率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:對(duì)胚胎發(fā)育第五天的蠶卵進(jìn)行高溫處理

3、，兩個(gè)品種的孵化率與高溫處理時(shí)間沒(méi)有相關(guān)性;對(duì)胚胎發(fā)育第六天的蠶卵進(jìn)行高溫處理，當(dāng)35℃處理36 h之前，孵化率并沒(méi)有明顯變化，但是處理36 h后sch孵化率開(kāi)始呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，處理50 h后sch的孵化率有明顯降低，降低至1.75％，而Dz在相同條件下處理其孵化率并沒(méi)有明顯變化，我們認(rèn)為sch在胚胎發(fā)育六天后，進(jìn)行高溫(35℃)處理36 h-50 h這個(gè)時(shí)間段以?xún)?nèi)胚胎對(duì)溫度的升高比較敏感。
　　2、不同溫度條件處理下家蠶伴性赤蟻

4、突變BmTh基因表達(dá)量和多巴含量檢測(cè)及BmTh酶抑制劑處理后表型觀察
　　本研究對(duì)不同溫度條件處理的家蠶伴性赤蟻BmTh基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。胚胎發(fā)育至“C”型胚時(shí)，對(duì)sch和Dz胚胎在25℃常溫和35℃高溫條件下分別處理24h和48 h。RT-PCR和熒光定量結(jié)果顯示:Dz胚胎內(nèi)的BmTh基因的表達(dá)量隨著溫度的升高、處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;而sch胚胎中，高溫處理24 h，BmTh基因的表達(dá)量隨著溫度的升高有明顯增加，但是高溫條件

5、下處理48 h后sch中BmTh的表達(dá)量卻比常溫下sch的表達(dá)量更低。另外，我們還對(duì) sch和Dz發(fā)育至點(diǎn)青期的蠶卵進(jìn)行不同溫度(25℃、30℃、35℃)處理16h，檢測(cè)BmTh酶下游產(chǎn)物多巴的含量，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種中多巴的含量均隨著處理溫度的不斷升高而逐步降低，但是sch蠶卵在多個(gè)溫度條件下，多巴含量總是低于Dz。對(duì)Dz、sch蟻蠶中多巴含量進(jìn)行檢測(cè)顯示，Dz蟻蠶中多巴的含量比sch蟻蠶多巴的含量要高。Dz添食TH酶抑制劑(3-IT)使其

6、活性受到抑制，添加抑制劑的Dz二齡起蠶頭部和體色呈白色，半月紋顏色與正常相比呈淺棕色，添加抑制劑的實(shí)驗(yàn)組存活率比對(duì)照組明顯降低，并且隨著抑制劑濃度越高和處理溫度越高，存活率越低。
　　3、Dz、sch胚胎不同溫度處理后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析
　　已經(jīng)清楚sch胚胎高溫致死的敏感時(shí)期，我們選擇胚胎發(fā)育至“C”型胚后高溫處理48h對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估顯示:測(cè)序的質(zhì)量分布Q30值均高于82.3％;測(cè)的序列與基因組比對(duì)效率比

7、較高，均在65％以上，其中uniquely mapped reads所占的比例均在97％以上;測(cè)序的cDNA分布均勻，測(cè)序飽和度也很好，多方面數(shù)據(jù)的評(píng)估均說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量相當(dāng)好，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組的分析，同時(shí)也暗示數(shù)據(jù)分析的可靠性。對(duì)相同品種不同溫度間比較和相同溫度不同品種間比較的差異基因進(jìn)行了GO分類(lèi)和COG分類(lèi)，這些數(shù)據(jù)為我們提供大量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和信息，為后期深入分析奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。比較Dz和sch兩個(gè)品種高溫(Dz-35℃vs Dz-25

8、℃和sch-35℃vs sch-25℃)處理后的差異基因，其中兩個(gè)品種分別高溫處理后共有的差異基因?yàn)?18個(gè)，僅存在于Dz或sch品種的差異基因分別為224個(gè)和242個(gè);與Dz品種相比，sch品種常溫和高溫處理后（sch-25℃vs Dz-25℃和sch-35℃vs Dz-35℃）的差異基因分析，共有的差異基因?yàn)?74個(gè)，僅為常溫或高溫處理組的差異基因分別為313個(gè)和210個(gè)。比較兩個(gè)品種高溫處理后共有的318個(gè)差異基因和sch品種高溫

9、處理后的210個(gè)共有差異基因，兩者共有的差異基因有24個(gè)，其中最多的一類(lèi)是表皮蛋白基因（9個(gè)），有趣的是，BGIBMGA012595基因都下調(diào)表達(dá)，推測(cè)其可能與sch高溫致死相關(guān)。
　　4、轉(zhuǎn)錄組代謝通路分析
　　根據(jù)果蠅黑色素代謝通路中關(guān)鍵基因序列，將家蠶中的同源基因在常溫和高溫條件下產(chǎn)生的差異基因中比對(duì)。結(jié)果表明:在常溫和高溫條件下，sch品種中BmTh、yellow-d、GTPCH表達(dá)量與DZ相比存在明顯差異，其中Bm

10、Th和yellow-d都下調(diào)表達(dá)，GTPCH上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn):35℃高溫處理時(shí)，幾丁質(zhì)分解途徑中關(guān)鍵酶幾丁質(zhì)表達(dá)量上調(diào)2.04倍，但是該酶的表達(dá)量很低，因此這樣的上調(diào)表達(dá)對(duì)幾丁質(zhì)的分解途徑?jīng)]有大的影響。
　　高溫條件處理下，Dz品種共有74個(gè)表皮蛋白差異基因，其中12個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，62個(gè)基因下調(diào)表達(dá);sch品種共有65個(gè)表皮差異基因，其中上調(diào)表達(dá)16個(gè)，下調(diào)表達(dá)49個(gè)。在這些差異基因中，共有19個(gè)基因注釋為幼蟲(chóng)表皮蛋白