多重PCR同步檢測MDV、APV和EDSV的技術研究.pdf

1、家禽養(yǎng)殖在我國具有悠久的歷史，隨著我國經(jīng)濟快速的發(fā)展，養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展規(guī)模與速度與日俱增，而制約其發(fā)展的主要難題是禽病，尤其是病毒性疾病。其中APV、MDV和EDSV是三種雞的B類傳染性疾病。通常，用于檢測病原體的主要方法有病毒的分離與鑒定、血清學鑒定以及PCR方法等。本文所要研究的多重PCR方法雖與常規(guī)PCR原理相同，但可以用于多種病毒的檢測，且與常規(guī)單一PCR一樣靈敏，是一種快速、有效的檢測方法，在病毒檢測領域具有廣泛的應用市場。

2、>　　本研究利用DF-1雞胚成纖維細胞分別增殖了MDV、APV和EDSV，并利用異硫氰酸胍法提取病毒DNA，然后根據(jù)三種DNA序列分別設計了1對特異性引物，并將擴增的片段克隆到pMD18-T載體中，以此建立了可同時檢測三種病毒的多重PCR方法，并優(yōu)化了多重PCR反應條件，最終確定了多重PCR反應體系為20μL:0.2μL GoTaq Flexi DNA polymerase(5U/μL),4μL5×GoTaq Flexi buffer,

3、0.4μL dNTP(10mM),2.4μLMgCl2(25mM),APV-F/R0.4μL,MDV-F/R0.4μL,EDSV-F/R0.2μL，模板各1μL，滅菌水8.0μL;反應程序為:94℃，5min;94℃，30s，54℃，30s，72℃，30s，循環(huán)40次;最后72℃，10min。
　　利用優(yōu)化后的多重PCR方法分別檢測了MDV、APV、EDSV以及任意組合，反應結果與預期結果一致，還檢測了其他對禽類危害也較大的病毒，

4、如NDV、AIV、ALV、IBDV和IBV，均無擴增片段，說明該方法具有較強的特異性。利用構建的陽性克隆質(zhì)粒，研究了多重PCR檢測的靈敏度，多重PCR檢測APV的靈敏度為103copies/μL，檢測MDV和EDSV的靈敏度同為104copies/μL。并且討論了多重PCR與單一PCR檢測一種病毒的靈敏度以及多重PCR中另一種病毒對檢測該病毒靈敏度的影響。
　　利用建立的多重PCR方法檢測了30份從本地農(nóng)貿(mào)市場收集的禽糞便樣，包括